论文部分内容阅读
卵巢癌发病率居妇科恶性肿瘤第二位,病死率居妇科肿瘤首位。由于其起病隐匿,早期患者通常无症状且缺乏有效的早期诊断与筛查手段,大多数患者明确诊断时已届晚期(FIGO stage Ⅲ-Ⅳ)。晚期患者的主要治疗方式为手术及术后辅助化疗。遗憾的是尽管近几十年来手术技术不断进步,新型化疗药物亦不断应用于临床,晚期卵巢癌患者的生存率至今仍无明显改善。因此寻求新的有效的辅助治疗手段,应用于晚期卵巢癌综合治疗,以期改善预后,提高患者生活质量,是当前的研究热点。光动力治疗(Photodynamic therapy, PDT)作为一种新兴的肿瘤选择性治疗方法,目前已经应用于临床喉癌等肿瘤的姑息治疗,且可以与其它抗肿瘤治疗联合应用,显示出较好的临床应用前景。光动力治疗的核心要素是光敏剂(Photosensitizers, Ps),一代光敏剂为混合物,毒性较大；二代纯化的光敏剂目前在临床上已有应用；在二代光敏剂的基础上加以特殊修饰成为三代光敏剂,以提高肿瘤靶向性,是光动力学研究的未来发展方向。21世纪以来,纳米科技迅猛发展,纳米医药有望在医疗领域取得革命性突破。以纳米载体作为给药系统能提高药物功效,降低毒性,且具有肿瘤靶向性,与传统给药方式相比具有独特的优势。叶酸受体在大多数肿瘤中高表达,因此叶酸可作为靶向分子修饰纳米载体,实现肿瘤靶向治疗。本课题基于上述学科前沿进展,拟制备叶酸修饰的纳米载体,携带光敏剂实现卵巢癌靶向光动力学治疗。本研究主要内容包括以两亲性共聚物聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)-聚乳酸(Polylactic acid, PLA)为材料,连接靶向基团叶酸分子(Folic acid, FA),制备携带国产二代光敏剂竹红菌乙素(Hypocrellin B, HB)的叶酸受体靶向的嵌段共聚物纳米载体,探索其制备工艺,检测其主要理化性质；之后进行体外实验研究验证叶酸分子修饰的纳米载体对卵巢癌细胞的体外靶向性,进一步验证该纳米载体介导的PDT对卵巢癌细胞系的杀伤效果。第一部分叶酸受体靶向纳米载体的制备及性质测定目的以两亲性共聚物聚乳酸-聚乙二醇(PEG-PLA)及连接叶酸分子的聚乳酸-聚乙二醇(FA-PEG-PLA)为材料,制备PEG-PLA和FA-PEG-PLA两种嵌段共聚物纳米载体,进一步在两种纳米载体上携带光敏剂HB,探索其制备工艺,并进行理化性质检测,评估其后续研究可行性。方法用旋转蒸发透析法制备携带HB的PEG-PLA及FA-PEG-PLA嵌段共聚物纳米载体溶液。去除溶液中游离的HB后,分别用透射电镜和动态光散射仪测得两种纳米载体的大小及粒径分布。室温下放置一星期,观察有无游离药物释放出来。在两种纳米载体溶液中加入等量甲醇,破乳后滤器过滤,滤液进行高效液相色谱(HPLC)分析,测得纳米载体携带HB的含量,计算包封率及载药量。将制备的纳米载体溶液真空冷冻干燥后备用。结果成功制备PEG-PLA 及 FA-PEG-PLA两种嵌段共聚物纳米载体,并成功包裹HB。两种纳米载体粒子均呈球形,粒径分布较一致,分散性好。PEG-PLA纳米载体的平均粒径为156.9 nm, FA-PEG-PLA纳米载体平均粒径为174.0 nm。HB-PEG-PLA纳米载体的包封率为96%,载药量为1.28%,而HB-FA-PEG-PLA纳米载体包封率为78.1%,载药量为1.04%。纳米载体冻干粉剂复溶后仍能保持其原有理化性质。结论成功制备携带HB的PEG-PLA及FA-PEG-PLA两种嵌段共聚物纳米载体。两种纳米载体性质稳定,包封率及载药量均符合体外细胞学实验要求,可以用于后续研究。第二部分应用叶酸受体靶向纳米载体增强卵巢癌细胞光动力杀伤的实验研究目的验证叶酸受体靶向纳米载体对差异表达叶酸受体的卵巢癌细胞的靶向作用,并探讨携带HB的纳米载体对两种卵巢癌细胞的杀伤作用及杀伤机制。方法设计叶酸受体引物,用定量PCR检测卵巢癌细胞系SKOV3及H08910叶酸受体的表达。将上述两种纳米载体与细胞共同孵育,设置不同孵育时间(0.5、1及2 h)或叶酸含量(0、5%及10%),在荧光显微镜下观察细胞荧光强度,验证细胞对纳米载体的靶向性摄入。用MTT法检测H08910细胞在不同HB剂型(游离HB、HB-PEG-PLA及HB-FA-PEG-PLA)、不同HB浓度(1、2、3和4 ug/m)及不同激光强度(0、0.5、1及2 J/cm2)光动力学照射后的相对存活率。在同一激光强度(2 J/cm2)照射下,MTT法检测SKOV3及H08910细胞在不同剂型(游离HB、HB-PEG-PLA及HB-FA-PEG-PLA)及不同HB浓度(1、2、3和4 ug/ml)PDT照射后的相对存活率。Annexin-V-FITC/PI双染后通过流式细胞仪检测两种细胞系PDT照射后细胞凋亡率及坏死率。结果1.定量PCR测得HO8910细胞的叶酸受体表达量明显高于SKOV3 (1.019±0.211 vs 0.126±0.016, P<0.01)o2.在一定范围内,细胞与两种纳米载体孵育时间越长,细胞内光敏剂荧光强度就越强(P<0.05)。含FA-PEG-PLA的细胞比PEG-PLA细胞荧光强度高(P<0.01)。HO8910与SKOV3相比,其细胞内HB-FA-PEG-PLA的荧光强度在无叶酸组(99.104±2.979 vs 94.651±2.173,P=0.027)、5%叶酸组(107.502±1.992 vs98.427±±1.369,P<0.01)及10%叶酸组(111.038±5.528 vs 102.416±2.493, P=0.013)都要高。H08910细胞中10%叶酸的纳米载体荧光强度与5%叶酸组无差别(111.0378±5.528 vs 107.502±1.992, P=0.215),而SKOV3细胞中两者有差别(102.416±2.493 vs 98.427±1.369, P<0.01)。叶酸含量再增加,荧光强度增强不明显。叶酸含量为10%时细胞内荧光强度最强,此含量适合后续实验。3. HO8910细胞接受光动力学处理后,能量在2 J/cm2,浓度2 ug/ml时HB-FA-PEG-PLA组细胞相对存活率低于游离HB组(0.222±0.027 vs 0.457±0.030,P<0.01)及HB-PEG-PLA组(0.222±0.027 vs 0.344±0.066, P=0.010),这时条件最合适；在其他参数时FA-PEG-PLA与PEG-PLA及游离HB的杀伤效应差别不理想。说明纳米载体介导的杀伤具有能量及浓度的依赖性。不同细胞在相同能量条件下接受HB-FA-PEG-PLA介导的光动力学处理,HO8910组与SKOV3组相比,其相对存活率在2 ug/ml (0.113±0.038 vs 0.376±0.091, P<0.01)、3 ug/ml (0.086±0.027 vs 0.284±0.099, P=0.022)及4 ug/ml (0.056±0.011 vs 0.120±0.067,P=0.007)时均较低,说明高表达叶酸受体的细胞对HB-FA-PEG-PLA介导的光动力学杀伤效果更为明显。4.流式细胞仪检测显示HO8910细胞与游离HB、HB-PEG-PLA及 HB-FA-PEG-PLA作用并接受光照射后凋亡率分别为75.55%,61.95%及64.53%；SKOV3与游离HB、HB-PEG-PLA及HB-FA-PEG-PLA作用并接受光照射后凋亡率分别为63.38%,41.68%及49.82%。可见HB主要通过诱导细胞凋亡来杀伤细胞。HO8910细胞接受HB-FA-PEG-PLA介导的光动力学处理后细胞早期凋亡率与HB-PEG-PLA组无区别(24.232±1.225 vs 23.324±4.512, P=0.753); SKOV3细胞中HB-FA-PEG-PLA早期凋亡率比HB-PEG-PLA组高(17.284±1.935 vs 10.744±1.253, P=0.008)。但 HB-FA-PEG-PLA介导的光动力学处理后HO8910细胞凋亡率高于SKOV3组(24.232±1.225 vs 17.284±1.935,P=0.006)。结论叶酸修饰的嵌段共聚物纳米载体对高表达叶酸受体的卵巢癌细胞具有靶向性,通过叶酸受体介导使更多的纳米载体携带光敏剂进入细胞内。HB-FA-PEG-PL A介导的杀伤作用强于HB-PEG-PLA组,叶酸受体高表达的卵巢癌细胞对HB-FA-PEG-PLA介导的光动力学杀伤更为敏感。与游离HB相同,HB-FA-PEG-PLA与 HB-PEG-PLA光动力学处理卵巢癌细胞后均可诱导细胞凋亡。HB-FA-PEG-PLA对叶酸受体高表达的卵巢癌细胞介导的凋亡作用较强。