在真核细胞中,由组蛋白H3,H4,H2A和H2B以及147bp核心DNA缠绕形成的核小体是染色质的基本结构单元。在DNA复制时,为了维持正常的染色质结构和功能,细胞不仅需要合成大量的组蛋白,而且需要将组蛋白的合成限制在S期。DNA复制过程中核心组蛋白的表达减少或缺失会破坏染色质结构,延迟S期的进程并导致有丝分裂停滞;而S期之外组蛋白的大量表达或过量积累会对细胞产生毒害作用。维持细胞内组蛋白的正常表达对于维持细胞周期的正常进行、基因组的稳定性、DNA损伤反应以及转录调控等有重要的作用。因此,有必要研究组蛋白基因表达的调控因子及调控机制。虽然已有报道个别组蛋白修饰可以调控组蛋白表达,但是大部分组蛋白修饰对组蛋白表达的影响尚不清楚。在本研究中,通过筛选组蛋白H3/H4的点突变体库,系统地探究调控组蛋白基因表达的组蛋白氨基酸残基和组蛋白修饰并进行了深入的分子机制研究。具体研究内容如下:1.组蛋白H3/H4突变体库的筛选。通过蛋白质免疫印迹(Western blot)技术筛选组蛋白H3/H4突变体库,寻找改变组蛋白表达的调控因子。结果在15种H3/H4点突变体里发现组蛋白水平减少,5种点突变体里组蛋白水平增加。2.Set1复合体催化的H3K4me3对组蛋白表达的影响研究。在调控组蛋白表达的H3/H4点突变体中,发现了H3K4位点的突变会显著降低组蛋白的水平。由于H3K4可以被甲基化,而且甲基化的H3K4与转录有直接的相关性。因此,重点研究了H3K4甲基化对组蛋白表达的调控作用。在酿酒酵母中,Set1是唯一催化H3K4甲基化的酶,缺失SET1不仅仅H3K4me3消失,而且组蛋白表达显著下降。同时,敲除Set1复合体里特异性调控H3K4me3的亚基SPP1或者突变影响H3K4me3的组蛋白位点(H3R2A、H3T6A、H3K14A/Q),均导致细胞里组蛋白显著下降。这些结果说明Set1复合体催化的H3K4me3对维持体内组蛋白的表达是必要的。进一步利用实时荧光定量发现Set1复合体催化的H3K4me3正调控组蛋白基因的转录水平。3.Set1复合体催化的H3K4me3对组蛋白基因表达调控的分子机制研究。组蛋白基因对HHT1-HHF1,HHT2-HHF2与HTA1-HTB1上存在着NEG负调控区域,通过结合抑制复合体HIR/Asf1/Rtt106来抑制组蛋白基因表达。通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)发现Set1以及催化的H3K4me3在组蛋白基因位点的结合与Rtt106完全相反。进一步Ch IP发现H3K4突变以及SET1的缺失会减弱Rtt106在NEG区域的结合,但是会导致Rtt106在组蛋白编码区的结合,说明Set1复合体催化的H3K4me3能阻止Rtt106扩散到组蛋白基因编码区。为探索H3K4me3阻止Rtt106的分子机制,通过免疫共沉淀(体内和体外Co-IP),在野生型菌株和set1Δ突变体里比较了Rtt106结合组蛋白的能力,结果发现敲除SET1明显增强了Rtt106与组蛋白的结合。接着将纯化的FLAG标记的Rtt106与纯化的重组组蛋白和组蛋白八聚体(野生型和H3K4me3)混合孵育,比较Rtt106与组蛋白的结合情况,结果证明H3K4me3直接抑制了Rtt106与组蛋白的结合。这些数据说明了Set1催化的H3K4me3通过破坏Rtt106与组蛋白的结合限制Rtt106从三个HIR依赖型基因座的NEG区域扩散到基因编码区。4.Set1复合体催化的H3K4me3对细胞寿命的影响研究。组蛋白表达和细胞寿命有着紧密联系。既然Set1复合体催化的H3K4me3调控组蛋白表达,因此通过衰老曲线的实验分析了其对细胞时序性衰老的影响,结果发现Set1复合体催化的H3K4me3通过调控组蛋白基因表达来维持细胞的正常寿命。研究Set1复合体催化的H3K4me3调控组蛋白基因表达,不仅从组蛋白修饰角度揭示了组蛋白表达调控的新机制,还为组蛋白的表达对细胞衰老的影响提供了新线索,从而为研究抗衰老药物提供了良好的靶点。