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目的: 作为着丝粒重要组件,Zwint-1参与招募动力蛋白激酶和动力蛋白,促进染色体运动或调控纺锤体检查点,在着丝粒组装和有丝分裂中期适当沉默 SAC起到关键作用,以此确保染色体正确分离。通过进一步实验,来考察Cdc20与 Zwint-1之间的关系,以及 D-box序列在这其中发挥的作用,为进一步理解控制染色体分离的分子机制打下基础。 方法: 经PCR、双酶切鉴定等一系列实验技术来构建重组质粒pCMV-myc-Cdc20、pcDNA3-flag-Zwint-1、pcDNA3-flag-Zwint-1ΔD-box、pEGFP-Zwint-1和 pEGFP-Zwint-1ΔD-box;采用胸腺嘧啶双阻断法将HEK293T细胞同步化在 G1/S期,用流式细胞术通过碘化丙啶染色来确定细胞时相,用Western blot检测Zwint-1蛋白在细胞周期的表达水平;使用放线菌酮和MG132处理细胞,经Western blot检测来观察Zwint-1蛋白在体内的降解情况;对HEK293T细胞转染了质粒 pCMV-myc-Cdc20,即过表达 hCdc20,做了Cdc20与 Zwint-1之间的免疫沉淀实验;过表达 hCdc20和 RNA干扰 Cdc20,用Western blot来检测内源性Zwint-1蛋白质水平;将分别编码Zwint-1-flag、 Cdc20-myc和 Ub-HA的质粒共转染 HEK293T细胞,做了体内泛素化分析;删除了 Zwint-1的两个D-box基序(128 RTQL131和203 RDKL206),将突变序列亚克隆进pcDNA3-flag,与质粒pCMV-myc-Cdc20共转染,用Western blot来检测D-box缺失的Zwint-1蛋白质水平。 结果: Zwint-1蛋白水平随细胞周期时相变化而变化;Zwint-1蛋白水平在用放线菌酮孵育8 h和16 h后显著降低,在用MG132孵育6 h和12 h后蛋白水平迅速增加;免疫沉淀结果为阴性;过表达 hCdc20使 Zwint-1蛋白质含量显著减少;RNA干扰抑制Cdc20活性时Zwint-1蛋白和cyclin B显著积累;当过表达Cdc20-myc时,Zwint-1蛋白多泛素化水平显著上升;缺乏D-box基序的Zwint-1不能被Cdc20识别降解。 结论: Zwint-1的蛋白水平随细胞周期出现周期性变化;Zwint-1通过 APC/C-Cdc20途径泛素化降解;其机制是Cdc20识别Zwint-1的D-box基序。