精神分裂症是影响全世界1%人口的严重中枢神经系统疾病。精神分裂症的发病原因众多,虽然多年来对该病进行了深入研究,但是其分子病理学机制仍然没有得到确证。环境和基因的共同作用导致了该疾病的发生和发展。近年来,儿童和青少年人群中使用抗精神分裂药物的患者越来越多。美国一个研究显示,在1993-2002年间,年龄≤20岁的人群中使用抗精神分裂症药物的人次增加了6倍。儿童和青少年使用药物的人群(年龄<18)占药物使用总人数的比例由1996-1997年的7%增加到2004-2005年间的15%。临床的研究显示,第二代抗精神分裂症药物对于精神分裂症初发的青少年患者有较好的效果,但是它们带给儿童和青少年患者的不良反应比成年患者更加严重,如锥体外系反应、镇静作用、催乳素升高及增加体重等。目前,关于儿童和青少年患者接受精神分裂症药物治疗的研究多集中在考察药物的疗效、耐受性以及不良反应这几个方面,而缺少关于药物对于处在发育时期患者中枢神经系统和行为影响的研究。临床前研究表明,青少年时期中枢神经系统的发育都经历着巨大的变化,如前额皮层、纹状体及海马脑区的多巴胺和5-羟色胺神经系统的突触连接及受体表达。所以阐明抗精神分裂症药物对儿童、青少年患者的治疗反应及副作用产生的影响具有重要的临床意义。动物研究也表明,青少年时期使用抗精神分裂症药物会改变动物脑内许多神经受体的表达:如多巴胺D1,D2和D4受体;5-HT1A和5-HT2A受体以及离子通道型谷氨酸NMDA和AMDA受体,而在成年动物实验中却未观察到这些特殊的改变。这些研究都强调儿童及青少年时期接受抗精神分裂症药物治疗后会改变大脑神经网络的原有预置的进程和正常行为的发展,而这些改变又会导致患者成年后对于药物反应的变化。青少年时期是中枢神经系统和行为发展的关键时期,所以关于药物对青少年使用者短期和长期影响精神和脑功能的研究是十分必要的,这样才能更好的评价儿童及青少年患者在药物使用中的受益与风险。近些年来,本实验室运用成年大鼠模型进行的相关研究发现,多次给予大鼠奥氮平或氯氮平(两种也常用于儿童和青少年精神分裂症治疗的第二代抗精神分裂症药物),药物抑制由苯环己哌啶(PCP)导致的大鼠运动增多的效应作用逐渐增强或减弱。这种药理作用的变化被诠释为敏感性,即药物的药理作用逐渐增强;或是称为耐受性,这与敏感性表现相反,即药物的药理作用进行性减弱。本研究重点考察了青少年大鼠早期使用抗精神分裂症药物后对其短期内或者成年后长期的药理效应变化的影响。本研究延续实验室前期模拟临床多次给药的范式,使用PCP诱导的青年大鼠运动增多这一经典的精神分裂症动物模型来考察青少年时期反复的药物作用对大鼠大脑功能和行为的短期及其成年后这种长期的影响及其相关的分子机制。为了进一步的评价抗精神分裂症药物和PCP对发育期间的青少年大鼠脑和行为功能的影响,本研究还使用了前脉冲抑制行为学装置定期考察了大鼠听觉惊跳反应行为。前脉冲抑制行为反映的是一个预先的低强度的惊跳刺激可以减低惊跳反应程度的现象。这个行为指标考察的是机体门控感觉通道的功能,其功能障碍在精神分裂症患者与接受多巴胺激动剂或NMDA受体阻断剂的动物上都有被观察到。此外,为了阐明短期和长期产生的行为药理学变化的分子机制,本研究中还考察了药物对脑源性神经营养因子(BDNF)的影响。BDNF是大脑中分布最广泛的神经营养因子家族中的一员,对于中枢神经系统的发育和经历依赖的突触可塑性等脑的许多功能都有十分重要的作用。临床研究发现,BDNF表达水平的异常改变是精神分裂症的发病原因之一,在患者外周血和脑内都观察到BDNF水平的降低。抗精神分裂症药物可以改变大脑内BDNF的表达,防止应激导致的BDNF水平下降,提示BDNF与抗精神分裂症的药物作用机制相关。此外抗精神分裂症药物的使用会引起前脑多巴胺D2受体表达的增加。因此我们预测,青年时期的抗精神分裂症药物的反复使用会对BDNF蛋白水平,D2和5-HT2A受体效应产生影响,而这些改变可能正是大鼠行为上表现出的对药物产生敏感性或耐受性变化的相关机制。综上,本课题使用PCP诱导的青年大鼠运动增多这一经典的具有筛选抗精神分裂症药物活性的动物模型,来考察多次给予青年大鼠抗精神分裂症药物后引起的短期和长期的行为改变并进行了相关的分子机制研究。首先,课题的第一部分我们研究在PCP诱导的青年大鼠运动增多模型中反复应用抗精神分裂症药物奥氮平(OLZ)、氯氮平(CLZ)和利培酮(RIS)后青年大鼠短期内再次接触到原有药物时的行为反应的变化。其次,在第二部分中评价了连续多次的给予青年大鼠OLZ,CLZ或RIS和抗抑郁药物氟西汀(FLX)后对其成年后再次暴露于原有用药时对药物疗效的反应变化。此外,该部分还进行了PPI测试,旨在考察青年大鼠的门控感觉通道的功能在发育期间是否受到了前期药物作用的影响。接着,在第三部分中考察了连续多次的给予成年大鼠CLZ后对其短期内再次暴露于CLZ产生的药效反应变化和门控感觉通道功能的影响,并进一步探讨了与CLZ耐受化和RIS敏感化药理作用相关受体机制。最后,在第四部分中探考察了多次在青年大鼠中应用OLZ,CLZ,RIS和(或)PCP产生的短期和长期的药理效应是否与改变脑源性神经营养因子表达水平有关的分子机制。第一部分多次应用第二代抗精神分裂症药物在苯环己哌啶诱导的青年大鼠运动增多模型中的短期行为药理学效应研究目的:研究在青年大鼠的PCP诱导的运动增多模型中反复应用抗精神分裂症药物OLZ,CLZ和RIS后青年大鼠短期内再次接触到原有药物时的行为反应变化。方法:青年雄性SD大鼠(鼠龄P 44)连续5天中按分组每天分别接受一次OLZ(1.0或2.0 mg/kg,sc),CLZ(10.0或20.0 mg/kg,sc),RIS(0.3或1.0 mg/kg,sc)或是VEH处理后立即放入运动行为检测仪器中,30 min后根据分组情况再分别接受PCP(3.2 mg/kg,sc)或VEH处理,然后大鼠再被放回原先的实验装置中继续检测60 min,每天总共检测大鼠运动行为90 min。5天给药后,大鼠不被打扰的在动物房饲养一天。次日(P 50)各组大鼠在不接受任何药物处理的情况下适应测试仪器一天。P 51天,根据分组设计安排,大鼠接受一次原有药物OLZ(0.5 mg/kg),CLZ(5.0 mg/kg),RIS(0.5 mg/kg)和PCP(3.2 mg/kg)的用药记忆的Challenge测试,运动行为的测试范式与5天给药一致,时程仍为90 min。结果:1)连续5天的OLZ处理持续地抑制了PCP诱导的青年大鼠运动增多。在Challenge测试中,原先接受过OLZ处理的两组的大鼠与未接受OLZ处理的大鼠运动次数上并无组间差异。2)CLZ也在5天中以剂量依赖性的方式持续抑制了PCP诱导的青年大鼠运动增多。在Challenge测试中所有青年大鼠再次接受CLZ的处理,曾经接受过CLZ处理5天的两组大鼠都比在青年时期未接受过CLZ处理的大鼠对PCP诱导的运动增多的抑制效果更弱,表明曾接受CLZ处理的大鼠再次暴露于CLZ时,药效反应出现了减弱,即出现药物耐受现象。3)RIS也在5天的行为药理学测试中持续抑制了PCP诱导的运动增多;在Challenge测试中,青年时期5天接受高剂量RIS(1.0 mg/kg)处理组的大鼠当再次暴露于较低剂量的RIS(0.5 mg/kg)时显示出比未接受过RIS组的大鼠更强的对PCP诱导的运动增多的抑制作用,即药物敏感化现象。结论:1.连续5天的RIS处理,使得RIS组的青年大鼠在Challenge测试中显示出了对RIS的敏感化现象,即RIS在这两组大鼠上对PCP诱导运动的抑制效果更强。青年大鼠在5天接受OLZ处理后的第三天再次暴露于OLZ时,对药物产生的敏感化记忆效应不显著。而连续5天多次给予CLZ后的第三天,CLZ组的青年大鼠再次接受CLZ处理时减弱了抑制PCP诱导的运动增加的效应,即药物耐受现象的产生。第二部分多次应用第二代抗精神分裂症药物和抗抑郁药氟西汀在苯环己哌啶诱导的青年大鼠运动增多模型中的长期行为药理学效应研究目的:1)评价短期连续多次的给予青年大鼠OLZ,CLZ或RIS和抗抑郁药物氟西汀(FLX)后对其成年后再次暴露于原有用药时对药物疗效的长期影响。2)研究大鼠青年时期多次接受OLZ,CLZ,RIS,FLX或PCP处理后,其门控感觉通道的功能在发育期间是否受到药物作用的影响。方法:青年雄性SD大鼠(鼠龄P 44)连续5天每天按分组分别接受一次OLZ(1.0或2.0 mg/kg,sc),CLZ(10.0或20.0 mg/kg,sc),RIS(0.5或1.0 mg/kg,sc),Fluoxetine(FLX 5.0或10.0 mg/kg,ip),PCP(3.2 mg/kg,sc)或VEH的处理,并在运动行为测试箱中接受共90 min的测定,测试范式与课题研究的第一部分中的操作一致。在P 49,67,77天时,大鼠分别进行一次前脉冲抑制(PPI)测试。待大鼠成年后,分别在P 75和96天,撤药状态下再次适应实验环境和仪器(30 min/天)。大鼠分别在成年时期的P 76或P 97,各进行一次Challenge测试。结果:1)连续5天的OLZ处理持续地抑制了PCP诱导的青年大鼠运动增多。在第1次Challenge测试中,原先接受过OLZ处理的两组的大鼠再次接受OLZ处理时显示出了更强的抑制PCP诱导的运动增多的效果。在第2次Challenge测试中也有同样的发现,即出现对药物敏感化现象。2)CLZ也在5天中以剂量依赖性的方式持续抑制了PCP诱导的青年大鼠运动增多。在Challenge测试中所有青年大鼠再次接受CLZ的处理,接受过CLZ 10 mg/kg处理5天的大鼠比在青年时期未接受过CLZ处理的大鼠对PCP诱导的运动增多的抑制效果更弱,表明曾接受CLZ处理的大鼠再次暴露于CLZ时,药效反应出现了减弱,即药物耐受现象。但该现象在第2次Challenge测试中并未检测到。3)RIS也在5天的行为药理学测试中持续抑制了PCP诱导的运动增多。在两次的Challenge测试中,青年时期5天接受较低剂量RIS(0.3 mg/kg)处理组的大鼠当再次暴露于RIS时比未接受过RIS处理的大鼠有更强的抑制PCP诱导的运动增多的作用,即敏感现象。4)两个剂量的FLX在5天的药物诱导阶段都没有抑制PCP诱导的运动增多的作用,同时也无增加PCP诱导运动增多的协同作用。两次的Challenge测试中,前期接受过FLX处理的两组大鼠再次暴露于FLX未显示出显著的敏感化或耐受化的药理效应。5)抗精神分裂症药物OLZ,CLZ,RIS和抗抑郁药物FLX及NMDA受体拮抗剂PCP均未对大鼠门控感觉通道功能产生影响。结论:1.青年大鼠在5天接受OLZ处理后等待28天和43天(即待其成年后),再次暴露于OLZ时,出现对药物敏感化的反应。RIS长期的研究结果与OLZ结果类似,青少年接受RIS处理会引起成年后的RIS两组大鼠显示出对RIS的敏感化反应,该药理作用同OLZ敏感化效应一样都是长期、稳定存在的。2.与OLZ和RIS结果不同的是,连续5天多次给予CLZ后的第28天,CLZ10组的大鼠成年后再次接受CLZ处理时产生药物耐受现效应。间隔5天给药的第43天进行的Challenge测试,未观察到CLZ耐受效应产生。说明CLZ所表现出的耐受现象虽能持续较长的时间,但是该药理效应不够稳定,会随着时间推移而逐渐减弱。3.抗抑郁药物FLX在PCP诱导的运动增多模型未显示出抑制作用,提示FLX不具有抗精神分裂症药的药理作用。同时表明该范式下的此动物模型可以用于筛选具有抗精神分裂症活性的药物或是用于区分具有抗精神分裂症活性与抗抑郁活性的药物。4.本部分研究中涉及的相关药物处理作用都没有影响大鼠门控感觉通道的功能。第三部分多次应用第二代抗精神分裂症药物氯氮平、利培酮的行为药理学受体机制研究目的:1)评价连续多次的给予成年大鼠CLZ后对其长期后再次暴露于CLZ产生的药效反应变化、对成年大鼠门控感觉的影响;及给予青年大鼠CLZ后短期内药理作用改变的相关受体机制的研究。2)研究5-羟色胺5-HT2A/2C受体或多巴胺D2/3受体是否参与青年大鼠短期内对RIS产生的敏感化作用。方法:1)在实验4.1中,第1-2天(鼠龄P 72-73)所有实验动物适应测试环境及测试箱。自第3天开始连续5天(P 74-78)给予成年大鼠CLZ(10.0或20.0 mg/kg,sc),VEH或(和)PCP,然后测定90 min内的大鼠运动行为变化。在P 79,97,107,分别进行一次PPI测试。在P 105和P 120天,分别让大鼠再次适应实验装置(30 min/次)。在大鼠成年后期的P 106或P 121,分别进行一次CLZ(5.0 mg/kg)的Challenge测试。2)实验4.2中,第1-2天(P 57-58)所有实验动物适应测试环境及测试箱,30 min/天。自第3天开始每隔一天(P 59,61,63,65,67)给予大鼠CLZ(10 mg/kg,sc)或VEH。然后放入运动行为测试箱测试90 min。P 69和72时,实验动物撤药状态下再次适应实验环境和仪器(30 min/天)。P 70天时,按分组进行分别进行QUI(0.2mg/kg,sc)或DOI(0.1 mg/kg,sc)的Challenge测试(120 min)。于P 73天时再按组别进行QUI(0.5 mg/kg)或DOI(1.0 mg/kg)的第二次Challenge测试。3)实验4.3中,第1-2天(鼠龄P 42-43)所有实验动物适应测试环境及测试箱。自第3天开始连续5天(P 44-48)给予青年大鼠RIS(1.0 mg/kg,sc)或VEH或(和)PCP,然后测定大鼠90 min内的运动行为。在P 49-74天,实验动物在动物房中正常饲养,不予打扰。在大鼠成年后P 75天,实验动物再次适应实验环境和仪器(30 min/天),于P 76天进行多巴胺D2/3受体激动剂QUI(1.0 mg/kg,sc)的Challenge测试。结果:1)5天中CLZ显著抑制了PCP诱导的成年大鼠的运动增多。但两次的Challenge测试中,CLZ两组大鼠再次接受CLZ时并未显示出耐受化的药理学效应。三次的PPI结果显示,药物处理也未损伤大鼠的门控感觉通道功能。2)5天中,CLZ组的大鼠运动次数显著低于VEH组,表明了CLZ的运动抑制作用。在第一次的QUI测试中,CLZ组大鼠的运动次数显著多于VEH组,同样的结果也出现在第二次的QUI测试中。两次的DOI行为药理测试中,大鼠的运动次数的组间差异不显著。3)5天给药阶段,接受RIS处理组的青年大鼠相比未接受RIS有更少的运动次数,表明RIS对PCP诱导的运动增多有抑制作用。但在大鼠成年后进行的QUI测试中,并未发现各组间差异。结论:1.青年大鼠早期使用CLZ会引起其日后对CLZ产生耐受化的现象,而这种现状在成年大鼠的实验中并未观察到,一方面说明青少年时期用药会对大鼠产生长期的影响,另一方面也表明CLZ的耐受化效应可能会随着大鼠年龄的增长而减弱,不能长期稳定的存在。2.反复的CLZ处理后大鼠对药效产生的耐受化反应可能与多巴胺D2/3受体敏感性增加相关,与5-HT2A/2C受体的相关作用无关。而青年大鼠对RIS表现出的敏感化效应可能与多巴胺D2/3受体的敏感性下降有关。第四部分多次应用第二代抗精神分裂症药物及苯环己哌啶对大鼠脑内脑源性神经生长因子表达水平影响的研究目的:1)研究多次在青年大鼠中应用OLZ,CLZ,RIS和(或)PCP产生的短期行为药理学效应是否与脑源性神经营养因子水平的改变有关。2)研究脑内BDNF蛋白水平改变是否是青年大鼠在短期多次接受OLZ,CLZ和(或)PCP处理后,成年时再次接触到原有药物时产生的敏感或耐受效应的分子机制。方法:在第一部分和第二部分行为学实验结束后的第二天,所有大鼠被处死、取脑并在冰上分离前额叶皮质(PFC)、纹状体(ST)和海马脑区组织(HC)。这些脑组织在RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂的混合物中进行匀浆,提取的蛋白经定量后(40 ug)用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离后转移到PVDF膜上。再将PVDF膜用含5%脱脂奶粉室温封闭后,分别孵育一抗(BDNF 1:100,β-actin 1:800)。4℃放置24小时后,PVDF膜用TBST洗涤3次,再在室温下孵育二抗1小时。在TBST洗涤3次后使用Li-COR Odyssey的Fc成像仪进行蛋白条带信号采集和定量分析。结果:1)多次给予青年大鼠OLZ和PCP处理后,PFC脑区的BDNF水平未见组间差异。而在ST和HC脑区,OLZ的两组大鼠BDNF水平较非OLZ处理的两组大鼠略有升高,但也未达到统计学意义。2)多次接受CLZ处理的两组大鼠三个脑区的BDNF水平较其他未接受CLZ处理的两组大鼠无显著差异。3)短期多次的应用RIS没有改变青年大鼠三个脑区的BDNF蛋白的水平。4)大鼠青年时期接受OLZ,CLZ和(或)PCP的处理并未影响其成年后PFC脑区BDNF的蛋白水平。结论:1.大鼠青年时期接受OLZ,CLZ,RIS和(或)PCP的处理并未影响其成年后PFC,ST和HC三个脑区BDNF的蛋白水平。脑中BDNF蛋白可能不是大鼠对OLZ或RIS产生敏感化而对CLZ产生耐受的直接分子。综上所述,本文研究工作的主要创新之处在于:1.拓展多次给药范式下的苯环己哌啶诱导的青年大鼠运动增多模型的内涵本研究在实验室前期的用成年动物模型探究抗精神分裂症药物行为药理学机制研究工作的基础上,选用青年大鼠来建立该模型,一方面为实验室前期研究结果提供进一步佐证;另一方面本研究建立的青年大鼠的PCP模型有助于开展评价抗精神分裂症药物对于青少年大脑和行为发育的影响的研究。此外,实验设计上应用同临床患者多次用药的模式更贴近的多次给药的实验范式来考察了青年大鼠用药后短期和长期内对药物反应的变化,这也是对临床上患者急性或慢性用药反应模式的一个近似模拟,有利于以贴近临床用药的方式来评价药物的机制。本研究也证明了青年大鼠建立的PCP诱导的运动增多模型可以有效的区分第二代抗精神分裂症药物OLZ,CLZ,RIS和抗抑郁药物FLX。以上都提示,多次给药范式下的PCP诱导的青年大鼠运动增多模型具有评价和筛选具有抗精神分裂症活性药物的良好功能,且该实验范式类似临床用药模式,可以为临床合理用药提供更好参考。2.表明了抗精神分裂症药物多次在青年大鼠上的应用会对大鼠再次用药产生短期或长期的影响青年大鼠早期使用抗精神分裂症药物OLZ和RIS后,当再次接受原有药物处理的时候会对药效出现增强的行为反应,这种敏感化的药物记忆效应可以长期稳定存在。而当大鼠早期接受CLZ处理后,却会对该药效的反应表现出递减的行为反应,且这种耐受化的行为表现会随着时间的推移而减弱。同时研究中也观察到大鼠对于PCP的反应也会随着给予次数增多而引起敏感化行为表现。本研究验证了实验室前期在成年大鼠上观察到的药效学改变的同时,也说明OLZ和RIS引起的敏感化及CLZ的产生的耐受化效应是药物内在固有的性质导致的,不受大鼠的年龄和实验范式及动物模型的影响。本研究评价了临床上主要用于儿童及青少年精神分裂症治疗的几种第二代抗精神分裂症药物对青年动物的影响,从而为临床上儿童和青少年合理用药提供参考。