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断奶仔猪腹泻(post-weaning diarrhea,PWD)通常在仔猪断奶时或断奶后的第1周发生,临床上的主要症状有腹泻、脱水、生长缓慢或停止生长等,仔猪的大量死亡给全世界养猪业带来巨大的经济损失。研究表明,断奶仔猪腹泻病例中超过45%是由特定血清型的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)造成的,其中K88占主要部分。由ETEC引起的腹泻一方面采用抗生素治疗,但随着耐药性的问题越来越严重,抗生素治疗效果逐步走低。另一方面则是使用疫苗治疗,针对K88 ETEC的疫苗主要有灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等三类,但存在一定局限性。灭活疫苗用量大,内毒素残留存在隐患,亚单位疫苗生产成本高,基因工程疫苗有毒力反强和整合到基因组的问题。随着分子生物学的发展,研发针对产肠毒素K88的新型抗体制剂受到了广泛关注。ScFv是保留完整抗原结合位点的最小功能性抗体片段,作为基因工程抗体具有多克隆抗体和单克隆抗体无法比拟的优势:分子量小、易于穿透;不含抗体的Fc片段,能够避免抗体分子与受体非特异性结合;ScFv能够在多种系统中表达,尤其是大肠杆菌;此外还可以基因工程改造,变为二价或多价单链抗体。制备单链抗体最常用的方法是噬菌体-单链抗体展示技术。本研究主要目的是将原核表达的ETEC K88 FaeG蛋白作为抗原,筛选针对产肠毒素大肠杆菌K88高亲和力的ScFv,将ScFv原核表达后研究其生物学功能,为ETEC抗体制剂的研发奠定基础。(1)首先设计了引物扩增了K88 faeG基因,将其连入表达载体pET28a(+),通过原核表达和纯化,获得了具有活性的重组K88 FaeG蛋白,为下步单链抗体的筛选奠定基础。(2)利用实验室已有的猪源单链抗体库,将表达的K88 FaeG作为筛选抗原,通过四轮筛选和富集,噬菌体文库的滴度达到了107CFU/mL,从第四轮淘选中随机挑取了48个克隆制备噬菌体抗体,采用噬菌体ELISA的方法,筛选到了6株针对K88 ETEC的猪源ScFv。对这6株ScFv的氨基酸序列分析,发现FR区域比较保守,CDR3区变异较大,尤其是VH和VL的CDR3区。(3)由于pCANTAB5e为E-tag标签载体,目前还没有很好的纯化E tag的方法。因此我们将筛选到的2株抗ETEC K88的ScFv克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,进行原核表达和纯化。然后研究了单链抗体的稳定性、特异性和亲和力。结果发现,单链抗体的能够在4℃保存一个月,不发生降解,在-20和-80℃能够长期保存;亲和力可以达到7.21±1.56和4.51±0.42M-1*105 Kaff;不会与猪的其它病原如大肠杆菌K99、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒发生反应。细菌粘附实验也说明我们制备的ScFv能够减少产肠毒素大肠杆菌K88对细胞的粘附作用。这些初步研究了ScFv的生物学功能,为仔猪腹泻病抗体制剂研发奠定基础。