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应用孕妇外周血中单个胎儿有核红细胞进行非损伤性产前基因诊断 背景 非损伤性产前基因诊断是单基因遗传病产前诊断的发展方向。非损伤性产前诊断对胎儿没有任何风险,对孕妇几乎没有痛苦与忧虑,易于接受与推广。但是这一领域的发展因材料与技术问题而较缓慢。一个多世纪以前就已经发现孕妇外周血中存在胎儿细胞。这些细胞提供了对胎儿进行产前诊断的可能性。孕妇外周血中存在的胎儿细胞有多种类型,其中胎儿有核红细胞生命周期短,表达较为特异的胎儿血红蛋白或胚胎血红蛋白,因而成为非损伤性产前诊断的较好材料。但是,这一理想的产前诊断技术存在的最大困难在于:1.孕妇外周血中的胎儿细胞数量极少;2.富集得到的细胞是否是真正的胎儿细胞难以确定。 目的 建立从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行单基因遗传病非损伤性产前基因诊断的策略与技术。 方法 取孕妇外周血(10ml/例),经三密度梯度离心分离,用联结抗CD71单抗的微磁珠进行细胞分离(MACS),经抗Hb F单抗进行免疫组化染色,用AP-Fast Red显色。以显微操作仪控制的玻璃针挑取单个阳性染色的细胞。分别置于单独的一个0.5ml薄壁PCR管中。经蛋白酶K消化,以15-mer的随机引物用引物延伸预扩增(Primer Extension Pre-amplification,PEP)法进行单细胞基因组预扩增。PEP产物作为随后进行的产前诊断PCR反应模板。在基因分析中,首先分析胎儿性别,以巢式PCR扩增ZFX/Y,扩增产物经Hae Ⅲ消化,PAGE电泳,确定胎儿性别,若为男性,则可作为确定所挑取细胞来源于胎儿的重要指标。之后,选择父母均为双杂合的多态性遗传标记分析母亲、父亲和所挑取细胞的基因型,根据STR的孟德尔遗传规律,确定所挑取细胞是