κ-卡拉胶的工业生产过程产生大量碱性κ-卡拉胶工业废渣,对其进行填埋会造成严重环境污染和资源浪费。κ-卡拉胶酶属于糖苷水解酶,通过作用κ-卡拉胶的β-1,4糖苷键将其降解成一系列偶数聚合度的寡糖。利用κ-卡拉胶酶对废渣中卡拉胶多糖水解回收κ-卡拉胶寡糖和助滤剂是废渣资源化利用的有效途径。已知的κ-卡拉胶酶耐碱性达不到工业应用要求,制约废渣的有效利用。假交替单胞菌JMUZ2来源的κ-卡拉胶酶具有良好的催化活性,但酶的耐碱性不高。本论文通过理性设计的方法对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶进行耐碱性改良,提高酶在碱性环境下的应用性能,不仅为κ-卡拉胶工业废渣的资源化利用奠定酶学基础,而且促进酶结构与耐碱性和催化活性的构效关系研究。论文的主要研究内容及结果如下:（1）基于表面电荷优化筛选和鉴定κ-卡拉胶酶耐碱性改良单点突变体。使用SWISS-MODEL在线服务器对κ-卡拉胶酶蛋白质序列进行同源建模,并评估模型的可靠性。通过GH16家族κ-卡拉胶酶蛋白质序列比对分析,并计算氨基酸残基的溶剂可及表面积,绘制该家族κ-卡拉胶酶表面残基序列谱图。选择κ-卡拉胶酶表面非保守的氨基酸残基进行突变,将酸性氨基酸突变为中性或碱性氨基酸,将中性氨基酸突变为碱性氨基酸,结合突变体能量计算,理性设计并构建8个单点突变体。突变体的酶活性和耐碱性分析结果显示,突变体D50N的酶活力比野生型（WT）提高25.4%,突变体E237R和D243N与WT酶活性无显著差异。突变体E237R在pH 10.0和pH 11.0条件下25℃处理30 min,残余酶活力比WT分别提高了14.2%和16.0%,说明E237R的耐碱性提高。在pH 8.0和pH 9.0条件下25℃处理30 min,突变体D50N的残余酶活力比WT分别提高了14.8%和10.6%,突变体D243N也分别提高了14.4%和8.7%,说明D50N和D243N的耐碱性也有所提高。突变没有改变酶的最适反应pH和最适反应温度。动力学参数分析显示,D50N、E237R和D243N的Km值降低,表明突变体与底物的亲和力提高。LC-MS分析显示,WT和上述三个突变体酶解κ-卡拉胶的终产物均为κ-卡拉胶二糖和四糖,说明突变对酶解产物的组成没有影响。（2）组合突变对κ-卡拉胶酶耐碱性的改良。将D50N、E237R和D243N进行组合,构建组合突变体D50N/E237R、D50N/D243N、E237R/D243N和D50N/E237R/D243N,突变体的酶活性和耐碱性分析显示,相较于WT,突变体D50N/D243N具有89.1%的相对酶活力,其他组合突变体酶活力下降较显著。在pH 9.0和pH 10.0条件下25℃处理30 min,D50N/D243N的残余酶活力分别比WT提高了6.2%和11.8%,说明D50N/D243N的耐碱性提高,但是没有表现出比单点突变体E237R更好的耐碱性。利用分子动力学模拟分析组合突变对酶结构稳定性的影响,发现点突变对距离较远残基的柔性存在影响,且突变点E237R与其他突变点存在非加和效应,同时组合突变体D50N/D243N也未表现出单点突变对结构影响的叠加状态,D50N/D243N与E237R的残基波动状态类似。（3）κ-卡拉胶酶耐碱性提高突变体的结构分析。荧光光谱分析发现,D50N、E237R、D243N和D50N/D243N突变体的荧光团残基疏水微环境和表面疏水性与WT相比无明显改变。利用TKSA-MC在线服务器计算κ-卡拉胶酶带电残基的相互作用,发现在pH 10.0条件下,第50位的天冬酰胺突变和237位的精氨酸突变,他们的ΔGqq值显著降低,有利于其自身结构的稳定性。利用Ring-2.0在线服务器分析κ-卡拉胶酶的残基相互作用网络,发现突变体D50N和E237R并未改变残基网络的作用方式,将243位的天冬氨酸突变为天冬酰胺有利于其与残基K229形成新的范德华力。分子对接结果显示,相较于WT,突变体D50N的对接自由能降低,分子动力学模拟显示,在有底物存在时,突变体D50N活性口袋区域残基的柔性增加,这暗示着其与底物的亲和力增加,有利于催化反应。利用恒pH下分子动力学模拟研究κ-卡拉胶酶在pH 10.0碱性环境下的结构变化,结果显示,相较于WT,突变体E237R在碱性环境下保持自身残基的灵活性,自由能曲线也说明E237R有适应碱性环境的能力。