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κ-卡拉胶酶的结构域功能分析对酶的结构与功能关系研究具有重要意义。卡拉胶是热溶性高分子,胶体溶液粘度随温度升高而降低,κ-卡拉胶酶的热稳定性改良促进酶法降解卡拉胶的应用研究。本论文通过对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶JMUZ2的结构域进行分析,从而构建了结构域截短的κ-卡拉胶酶GH（缺失Ig样结构域）,研究JMUZ2和GH的酶学性质,探究Ig样结构域对κ-卡拉胶酶JMUZ2的影响。同时基于理性设计提高假交替单胞菌κ-卡拉胶酶JMUZ2的热稳定性,进行了定点突变,获得了热稳定性显著提高的突变体。对突变体与野生型κ-卡拉胶酶进行分子动力学模拟等结构对比,分析热稳定性提高的原因。本论文研究为假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的结构与功能关系研究、酶的应用奠定良好基础。本论文通过生物信息学线上工具对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶JMUZ2的结构域进行分析,并构建了结构域截短的κ-卡拉胶酶GH。以κ-卡拉胶为底物,研究假交替单胞菌κ-卡拉胶酶JMUZ2及其结构域截短酶GH的酶学性质。结果显示,κ-卡拉胶酶JMUZ2的分子量大小约为44 kDa,GH的分子量大小约为35 kDa。κ-卡拉胶酶JMUZ2和GH均专一性地酶解κ-卡拉胶。κ-卡拉胶酶JMUZ2和GH的最适反应温度均为50℃,最适反应pH均为8.0,说明Ig样结构域不影响酶的最适反应温度和最适反应pH。在不同温度和不同pH条件下处理后,GH的剩余酶活力高于JMUZ2,说明Ig样结构域影响了该κ-卡拉胶酶的热稳定性和pH稳定性,该结构域截短可提高酶的稳定性。与κ-卡拉胶酶JMUZ2相比,GH对底物的亲和性更高,表现在具有更低的Km值,说明Ig样结构域影响了酶对底物的结合亲和力,截短可提高该酶对底物的亲和力。通过Discovery studio 2019软件预测热稳定性提高的突变体,选择6个单点突变体,以实验室前期构建的野生型κ-卡拉胶酶重组质粒为模板,对所选位点进行定点突变,突变酶表达后利用亲和层析进行纯化。酶活力分析结果显示,与野生型κ-卡拉胶酶相比,G198S突变酶活力有明显的提高,而其它突变体均有所下降。对κ-卡拉胶酶JMUZ2和突变体G198S进行热稳定分析,结果显示,在40-60℃处理30 min后,G198S在45℃以上的残余酶活力明显高于野生型,在60℃处理后,G198S仍有35%的剩余活力,而JMUZ2几乎没有活力。在50℃条件下,与JMUZ2相比,G198S的半衰期提高了27.8 min。上述结果表明,成功获得假交替单胞菌κ-卡拉胶酶JMUZ2热稳定性提高突变体。探究突变κ-卡拉胶酶G198S的结构,分析该突变体热稳定性提高的原因。利用圆二色谱和荧光光谱对κ-卡拉胶酶JMUZ2和G198S的二级、三级结构进行分析,结果表明突变前后卡拉胶酶的二级、三级结构没有明显的改变。突变体G198S的三维结构分析显示,突变位点G198S距活性中心较远。突变体G198S分子对接结果显示,突变体与底物结合过程中,Trp95、Ile149、Tyr146、Tyr64、Trp144、Trp67、Tyr161、His183、Glu163、Glu168、Ala142等残基与κ-卡拉胶四糖形成了疏水相互作用。另外,分子动力学模拟分析显示,G198S在180-220位氨基酸的RMSF值略低于JMUZ2,表明突变后蛋白的刚性增强,这可能是突变体热稳定性提高的原因。综上,假交替单胞菌κ-卡拉胶酶的Ig样结构域不影响酶的底物特异性、最适反应温度、最适反应pH,但影响酶的热稳定性、酸碱稳定性、酶对底物的亲和力。通过Discovery studio2019软件预测及突变酶的热稳定性分析获得了一个热稳定性提高的κ-卡拉胶酶突变体G198S,利用分子动力学模拟分析,表明蛋白的刚性增强可能是突变体热稳定性提高的原因。