论文部分内容阅读
番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）是以感染番鸭出现“肝白点”为主要病变特征,并可引起软脚,喜卧,趾、跗关节肿胀等症状的一种传染性很强的病毒。2001年以来,本实验室分离出多株番鸭呼肠孤病毒,其中包括不同致病力的YB株和YJL株。经测序分析,YB株与MDRV法国89026株的S4基因同源性达94%以上,而YJL株与禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）S1133株、176株的S1基因之间同源率高达96%以上,YB株与YJL株之间S组基因同源性低于30%。YB毒株在临床上表现为高致病力的特点,能够引起高的致死率,YJL毒株,在临床上对番鸭表现为低致病力的特点。由于两毒株在临床症状上有着类似发病症状和致病机理,通过临床诊断鉴别比较困难,所以建立一种快速、高效、特异的检测方法对于临床上区分不同致病力毒株具有重要意义。YJL株的S1基因编码P10、P17和σ C三个蛋白,而YB株的S4基因编码P10和σC两个蛋白,不含有P17蛋白,且两个毒株的P10蛋白基因的同源性极低。根据这2株病毒基因特点,分别针对YB株P10蛋白基因和YJL株P17蛋白基因设计2对特异性引物,通过条件优化成功建立了可鉴别这2个毒株的双重RT-PCR。结果显示:该方法可同时扩增出YB288 bp、YJL441 bp长度的特异性片段,而对其他番鸭病病原无扩增结果;该方法最佳反应条件为95℃预变性5 min,94 ℃1 min,55℃ 45 s,72℃ 1 min,30 个循环,72℃延伸 10 min;该方法最低能检出10 pg YB和YJL株RNA模板;使用单重PCR和多重PCR方法对60份临床疑似病料检测验证,两者符合率为100%。结果表明该方法特异性、敏感性和重复性良好,具有快速、准确的特点,可用于这2种不同致病力毒株的鉴别。针对临床上番鸭群存在不同致病力毒株感染情况,为该病的防治增加了难度,因此对其致病机理的阐明显得尤其重要。在病毒感染的过程中,对宿主免疫器官和嗜性器官有致凋亡的作用,本研究用2株病毒（YB株与YJL株）对宿主、原代鸭胚成纤维细胞（Muscovy duck embryo fibroblasts,MDEF）感染,探讨2株病毒诱导细胞凋亡的情况。实验首先测定两毒株的TCID50,用MTS法测定病毒感染后12h、24h、36h、48h、72h、96h共6个时间段的MDEF细胞活力,根据细胞活力出现的拐点时间用荧光显微镜、DNA Ladder提取、流式细胞仪检测三种方法,对病毒诱导的细胞凋亡情况进行了定性和定量检测;最后用Western Bloting检测宿主肝脏细胞、脾脏细胞以及MDEF细胞的（48h、72h）空白组、YB、YJL接毒组共12份细胞样品中的凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平。结果表明:YB毒株在MDEF细胞上的TCID50远高于YJL毒株,为其3倍。MTS活力检测出细胞接毒组活力拐点在48h,有大幅活力降低现象,YB组活力低于YJL组。荧光显微镜在48h可观察到YB和YJL组均能诱导细胞早期凋亡,YB比YJL株表现出更多的晚期凋亡。DNA ladder检测表明,两个毒株均表现出经典的Ladder特征,YB组比YJL组时间更早,Ladder更明显,空白组未出现。流式细胞仪检测结果表明,YB组诱导组织细胞凋亡的能力高于YJL组,YB组肝脏细胞凋亡水平远高达75%,脾脏为23%,症状明显期肝脏细胞凋亡集中于中晚期,脾脏细胞凋亡分布于各个时期;YJL组肝脏、脾脏水平相差不大,均在10%左右;检测MDEF细胞凋亡发现,48h的接毒组较空白组细胞凋亡水平明显增加,72h的YB组凋亡细胞主要处于中晚期,YJL组则在早、中晚期均有分布。Western Bloting检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平发现,空白组肝脏和脾脏未见活化的Caspase-3（17KD）蛋白表达;YB组肝脏、脾脏细胞活化的Caspase-3（17KD）有明显增量表达;YJL组肝脏和脾脏则有少量活化的Caspase-3（17KD）表达。MDEF空白细胞48h和72h Caspase-3蛋白没有明显活化,MDEF细胞72h的YB组Caspase-3蛋白活化水平较空白组明显增加;YJL组Caspase-3蛋白活化水平表达量较YB组明显低了很多,72h较48h活化水平增加。本研究对2株不同致病力毒株建立了一种快速高效的双重RT-PCR诊断方法,对实际生产、实验室诊断提供借鉴;并从细胞凋亡角度对两毒株的致病机理进行了研究,确定了两毒株的感染能力,以及两毒株致细胞发生病变的时间拐点和具体的凋亡水平和时间,为后续病毒蛋白功能和相关信号通路研究提供了基础数据;从对宿主肝、脾组织进行凋亡检测结果来看,病毒致细胞凋亡在病毒感染机体机制中扮演重要角色。