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第一部分早期糖尿病肾病miRNA差异表达谱分析目的建立db/db小鼠早期糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）microRNA（miRNA）的差异表达谱,为进一步探讨microRNA在早期糖尿病肾病发生机制的作用提供依据。方法db/db小鼠是Leptin受体基因缺陷导致的先天肥胖性2型糖尿病小鼠,4～5周后出现明显肥胖,血糖显著增高,8～10周后出现微量白蛋白尿,肾脏发生损害,其发病过程与人2型糖尿病肾病非常相似,是国际上广为采用的研究糖尿病肾病的动物模型。采用12只9周龄雄性有高血糖且24h尿白蛋白（24-h urine albumin excretion,UAE）显著增高的db/db小鼠作为早期糖尿病肾病动物模型,12只9周龄雄性背景具有同质性的db/m小鼠作为正常对照,一半用于miRNA芯片检测,另一半用于实时荧光定量RT-PCR检测。Trizol法抽提肾脏总RNA,YM-100微离心滤器富集小RNA,含568个探针的miRMouse10.0071620 miRNA芯片检测糖尿病肾病组和对照组miRNA的差异表达谱。利用TaqMan MicroRNA Assays定量RT-PCR试剂盒,以snoRNA202作为内标,对部分差异表达的miRNAs进行实时定量PCR检测。结果9周龄db/db小鼠出现高血糖且UAE显著增高,提示进入早期糖尿病肾病阶段。miRNA芯片检测发现有480个miRNAs在糖尿病肾病组中表达,214个miRNAs在对照组表达。糖尿病肾病组和对照组肾脏组织表达的miRNA有66个miRNAs差异有显著性（p<0.01）,其中35个miRNAs在糖尿病肾病组呈高表达,31个miRNAs在糖尿病肾病组呈低表达,差异倍数从1.1至10.2。在这66个miRNAs中有7个miRNAs在早期DN组和对照组的表达量信号值均大于1000,且差异显著（两组差异≥1.55倍）,在早期DN组和对照组的表达量信号值均较高提示可靠性、可重复性较好;差异显著表明与DN关系密切。这7个miRNAs分别为:miR-196a,miR-98和miR-29c在糖尿病肾病组高表达,miR-21,miR-451,miR-709和miR-187在糖尿病肾病组低表达。利用TaqMan MicroRNA Assays定量RT-PCR试剂盒对部分miRNAs进行TaqMan探针荧光定量PCR,比较定量PCR结果与芯片结果,发现定量PCR结果与芯片结果趋势一致,表明芯片结果是可靠的,miRNAs参与了早期DN的发生。其中在细胞的增殖、分化方面尤为活跃的miR-21受到关注。结论部分miRNAs在糖尿病肾病和正常对照肾脏组织中存在差异表达,可能参与了糖尿病肾病发生的分子机制。第二部分MiR-21的构建及靶基因的预测研究目的microRNA（miRNA）芯片结合实时荧光定量RT-PCR检测发现的糖尿病肾病相关miRNA-miR-21的基础上,构建miR-21真核表达载体,预测miR-21的靶基因,为进一步了解miR-21的生物学功能及在糖尿病肾病中的作用奠定基础。方法人工合成小鼠糖尿病肾病相关的miRNA-miR-21基因序列,并添加酶切位点及poly T转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入真核表达载体pGenesil-1中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-21真核表达载体（pGenesil-miR-21）。运用生物信息学技术预测miR-21的靶基因。结果合成的miR-21基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pGenesil-1上。通过生物信息学技术,应用互联网上miRNA靶基因预测软件（Pictar、Targetscan、MiRbase、MiRanda等）在线服务站点搜索miR-21预测的作用靶基因,发现糖尿病肾病相关基因-张力蛋白在10号染色体上同源缺失的磷酸酶（Phosphatase and a tensin homolog deleted from chromosome 10, PTEN）基因3’-UTR区有16个碱基位点与mmu-miR-21匹配,结合NCBI文献检索对靶序列进行综合分析发现,有实验室通过构建双荧光素酶报告基因检测系统发现miR-21可通过结合与PTEN基因的3’UTR发挥其抑制靶基因表达的生物功能,因此PTEN基因可确立为miR-21的靶基因。结论miR-21真核表达载体的构建,为进行miR-21在体内外表达的研究奠定基础,靶基因PTEN基因的初步确立,为进一步探讨miR-21在糖尿病肾病的信号途径分子机制提供依据。第三部分MiR-21调控肾小球系膜细胞增殖的PTEN/PI3K信号途径研究目的了解糖尿病肾病相关miRNA-miR-21在小鼠肾小球系膜细胞高低糖浓度培养下高表达对细胞生长、增殖的影响,及高表达miR-21的细胞PTEN/PI3K信号途径关键分子的变化,为探索miR-21调控肾小球系膜细胞增殖的分子机制提供线索。方法采用高低糖浓度培养的小鼠肾小球系膜细胞模拟糖尿病及正常状态, Lipofectamine 2000转染miR-21真核表达载体（pGenesil-miR-21）,G418筛选,稳定表达。细胞共分为4组,分别为:高糖肾小球系膜细胞转染pGenesil-miR-21组、高糖肾小球系膜细胞转染对照空质粒组、高糖肾小球系膜细胞未转染组和低糖肾小球系膜细胞对照组。运用MTT法检测细胞增殖,real-time RT-PCR检测转染质粒细胞miR-21的表达水平,western blot、免疫细胞组化检测PTEN/PI3K信号途径关键分子PTEN、p-Akt（Ser 473）和PI3K p85α的蛋白质表达水平,生物学软件分析图像结果。结果实时荧光定量RT-PCR检测miR-21表达的结果显示,在转染pGenesil-miR-21重组质粒的小鼠肾小球系膜细胞中,miR-21的表达量比转染对照空质粒的系膜细胞高约12倍,具有显著性（p<0.01）,提示筛选出的系膜细胞能稳定高表达miR-21。MTT法细胞增殖检测结果发现,高糖培养的转染对照空质粒和未转染系膜细胞增殖能力显著高于低糖下的系膜细胞,但在高糖培养的系膜细胞中miR-21重组质粒转染后其细胞增殖能力明显抑制（p均<0.01）。同时,western blot和免疫细胞化学结果显示,pGenesil-miR-21组PTEN蛋白质表达水平呈显著低于对照空质粒组和未转染组（p均<0.01）,而p-Akt（Ser 473）和PI3K p85α蛋白质水平在pGenesil-miR-21组显著高于对照空质粒组和未转染组（p均<0.01）。结论miR-21通过特异性靶向抑制PTEN蛋白表达,提高p-Akt（Ser 473）和PI3K p85α蛋白表达水平以减缓肾小球系膜细胞增殖,可能是一个预防和治疗糖尿病肾病新型的潜在靶点。第四部分MiR-21调控db/db小鼠早期糖尿病肾病PTEN/PI3K信号途径研究目的了解糖尿病肾病相关的miRNA-miR-21对db/db小鼠早期糖尿病肾病发病的影响,及尾静脉液压法注射pGenesil-miR-21的db/db小鼠24h尿白蛋白（24-h urine albumin excretion,UAE）、肾小球形态学、及PTEN/PI3K信号途径关键分子的变化,为探索miR-21调控糖尿病肾病肾小球系膜增生的分子机制提供线索。方法24只5周龄雄性小鼠分为4组:6只db/m小鼠作为对照组,18只5周龄高血糖且无蛋白尿的db/db小鼠分别随机分到:pGenesil-miR-21质粒处理组、对照空质粒处理组及未处理组,每天尾静脉液压法注射质粒30mg/kg/d,直至未处理组db/db小鼠UAE显著高于db/m小鼠组。在光学显微镜下观察肾小球形态大小,计算机计算肾小球面积,电镜检测肾小球形态学改变,real-time RT-PCR检测肾脏组织miR-21的表达水平,western blot、免疫组化及激光共聚焦检测PTEN/PI3K信号途径关键分子PTEN、p-Akt（Ser 473）和PI3K p85α肾脏组织的蛋白质表达水平及定位。结果5周龄db/db小鼠连续注射质粒4周后,未处理组db/db小鼠出现高血糖伴UAE显著增高,提示9周龄db/db小鼠进入早期糖尿病肾病阶段。Real-time RT-PCR结果显示,在注射pGenesil-miR-21重组质粒的db/db小鼠肾脏组织中,miR-21的表达量比注射对照空质粒的db/db小鼠肾脏组织高3倍多,差异具有显著性（p<0.01）,提示液压法尾静脉注射的方法可以使miR-21在小鼠肾脏高表达。光镜观察和肾小球面积测量实验发现,早期DN的db/db小鼠肾小球较正常对照db/m小鼠增大,但注射pGenesil-miR-21重组质粒的db/db小鼠中,其肾小球较注射对照空质粒和未注射质粒的db/db小鼠肾小球均减小。进一步电镜检测发现,注射对照空质粒和未注射质粒的9周龄db/db小鼠肾小球上皮细胞足突融合,系膜增生,出现早期肾脏损害,但注射pGenesil-miR-21重组质粒的db/db小鼠中,系膜增生明显抑制,足突融合不明显,毛细血管内皮细胞无肿胀,系膜细胞无肿胀,提示连续4周每天液压法尾静脉注射miR-21质粒可抑制db/db小鼠肾小球系膜增生。western blot和免疫细胞化学结果显示,miR-21处理组的db/db小鼠肾脏组织中PTEN蛋白较注射对照空质粒和未注射质粒的db/db小鼠组显著降低,而PI3K p85α和phospho-Akt （Ser473）蛋白显著增高（p均<0.01）,且激光共聚焦进行荧光双标实验检测发现PI3K p85α和phospho-Akt （Ser473）蛋白在miR-21处理组的db/db小鼠肾脏中呈共增长的状态。结论miR-21通过特异性靶向调控PTEN/PI3K信号传导途径,以抑制肾小球系膜增生,可能是一个新的糖尿病肾病的保护因子。