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【研究背景】癌症被认为是一种自我更新能力不受调控的疾病,严重危害着人类的生命健康。自20世纪中叶随着肿瘤干细胞学说（Cancer stem cells,CSCs）的提出,极大的激起了学者对肿瘤起源的研究兴趣。肿瘤干细胞通常由成体干细胞（Adult stem cells）,祖细胞（Progenitor cells）和分化的细胞突变转化而来。间充质干细胞作为成体干细胞的一种,当遭受致癌基因突变后,细胞的基因表达、细胞信号转导途径及细胞微环境发生改变,转化形成肉瘤干细胞（Sarcoma stem cells,SSCs）,肉瘤干细胞在长期的自我更新中受到致癌突变诱导去分化转为肉瘤起始细胞,并最终形成肉瘤细胞,间充质干细胞在恶性转化或上皮间质转化（EMT）途径参与了肉瘤的发生。肉瘤是来源于间叶组织形成的恶性肿瘤,尤以骨肉瘤、横纹肌肉瘤恶性程度高,生长迅速,是一类高度异质性的肿瘤,目前尚无有效的预防措施。在肉瘤发生进展过程中,SSCs一直存在,是后续疾病转归中转移复发的重要始因。致癌基因突变是肉瘤形成的重要因素之一,其中包含PTPN11（Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11）激活突变,PTPN11是一种由非受体酪氨酸磷酸酶激酶（PTP）编码的原癌基因,可编码SHP-2蛋白,其结构为2个串联排列的N端的SH2结构域（N-SH2,C-SH2）和一个SHP-2的C末端的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）结构域所构成。N-SH2结构域作为构像开关,可结合或抑制磷酸酶。处于生理状态时,SHP-2的催化活性极低;当SHP-2突变时,N-SH2结构域和PTP结构域的在解耦联状态下可以与磷酸酶蛋白结合从而并激活下游的磷酸化信号通路。SHP-2与癌症发展关系密切,SHP-2激活突变导致了下游致癌信号通路的异常激活,调控肿瘤细胞异常的恶性增殖和分化,在多种实体肿瘤和白血病疾病模型中被发现,SHP-2能通过加速肿瘤干细胞的扩增参与了实体肿瘤的衍生。有文献证实,在横纹肌肉瘤中也存在着Ptpn11激活突变,然而其在肉瘤发生的作用及机制不清楚的。课题组前期结果发现:Ptpn11E76K/+激活突变的MSCs可以发生恶性转化,且突变的MSCs中有少量PDPN+亚群。PDPN+已报导在多种类型的人类癌症中都发现其高表达。通过流式细胞分选出PDPN+亚群的MSCs具有形成肿瘤微球的能力,也可以在裸鼠和C57BL/6J小鼠体内形成肿瘤,揭示我们Ptpn11E76K/+中PDPN+亚群可能为小鼠MSCs的肿瘤干细胞标志物。但究其原因Ptpn11突变后MSCs如何转化成PDPN+的CSCs导致肉瘤形成的机制是不清楚的。为了探索其机制,将Ptpn11+/+MSCs与Ptpn11E76K/+MSCs送出做蛋白质组学分析,找寻到参与脂筏形成差异蛋白在突变MSCs表达是降低的。文献已报道脂筏是肿瘤干细胞信号转导的枢纽,是细胞膜上物质运输的平台,提供了肿瘤细胞的能量代谢,参与了肿瘤的发生发展增殖转移等。Caveolin-1是脂筏经典标志性蛋白,也是构成细胞膜的主要支架蛋白。提出科学猜想Ptpn11E76K/+MSCs中诱导转化成PDPN+亚群肉瘤干细胞是否伴随着脂筏的积累。在前期肉瘤模型前提的基础之下,探究是否可能通过靶向脂筏的形成来遏制肉瘤的进展。为了验证上述猜想,首先检测了Ptpn11E76K/+MSCs恶性转化过程中脂筏的表达是增加的,随后选用了mβCD（脂筏经典抑制剂）,将分离纯化的Ptpn11E76K/+MSCs用mβCD处理后,发现可抑制了脂筏特征性蛋白（Caveolin-1）的表达。另外,通过体外细胞相关实验及体内移植瘤实验成功验证其破坏脂筏的形成后,可降低肉瘤干细胞在细胞膜上的富集,遏制肉瘤的发生与进展,同时也为肉瘤的治疗提供一个全新的视角。【研究方法】1.Mx1-cre工具鼠与Ptpn11E76K/+小鼠杂交,基因型鉴定出Ptpn11 E76K-neo/+小鼠,在6-8周龄时腹腔注射p I-p C（20ug/只）,隔2天注射一次,注射3-4针剂。一个月诱导Cre酶在骨髓的间充质干细胞中表达,从而在小鼠体内诱导骨髓间充质内Ptpn11E76K/+激活突变,再通过体外分离小鼠骨髓及其密质骨纯化得到Ptpn11+/+（野生型）和Ptpn11E76K/+（突变型）原代间充质干细胞。2.通过免疫荧光和Western blot检测Ptpn11E76K/+MSCs恶性转化过程中脂筏标志性蛋白caveolin-1表达情况。3.用mβCD处理Ptpn11E76K/+MSCs破坏脂筏,通过Western Blot与免疫荧光检mutant-MSCs与药物处理的后caveolin-1蛋白差异表达。体外检测mβCD处理mutant-MSCs对细胞生物学行为的影响:（1）细胞增殖能力:CCK-8;（2）细胞集落生长能力:平板克隆;（3）细胞非锚定生长:软琼脂集落形成;（4）细胞迁移侵袭功能:Transwell实验。4.通过肿瘤微球培养验证肿瘤细胞的干性,对比药物处理前后突变的Ptpn11E76K/+MSCs内形成肿瘤微球的大小和数目变化。5.通过流式细胞术检测药物处理前后活化突变的MSCs内肿瘤干细胞PDPN+亚群的相对占比。6.在C57BL/6J小鼠体内进行皮下成瘤实验,腹腔药物给予短时治疗,验证mβCD处理后对肿瘤生长的影响。7.通过蛋白质组学找寻影响肉瘤形成的差异表达基因,探索靶向脂筏抑制SSCs形成的相关机制。【实验结果】1.Ptpn11E76K/+MSCs中相对Ptpn11+/+MSCs,Caveolin-1的蛋白表达明显增加;2.肉瘤干细胞表面分子PDPN和脂筏特征性分子caveolin-1在Ptpn11E76K/+MSCs内能共定位表达;3.mβCD能显著抑制Ptpn11E76K/+MSCs细胞增殖及其他恶性行为学能力;4.mβCD能抑制Ptpn11E76K/+MSCs内标志性脂筏蛋白caveolin-1的表达;5.mβCD可抑制Ptpn11E76K/+MSCs内PDPN+亚群在脂筏上的富集及肿瘤干细胞的相对占比;6.mβCD抑制Ptpn11E76K/+MSCs内肿瘤干细胞形成肿瘤微球的能力;7.Naga的缺乏参与了脂筏的形成,与Ptpn11E76K/+MSCs肉瘤干细胞形成密切相关;8.mβCD能显著抑制移植瘤模型中小鼠体内肉瘤生长增殖的能力。【结论】1.Ptpn11E76K/+MSCs相对于Ptpn11+/+MSCs中,caveolin-1表达增加;2.鉴定出PDPN位于Ptpn11E76K/+MSCs脂筏结构中,可能是小鼠肉瘤干细胞的新标志物;3.脂筏可能参与Ptpn11E76K/+MSCs中PDPN+肉瘤干细胞的形成,并参与肉瘤的形成,mβCD可降低了Ptpn11E76K/+MSCs中PDPN+肉瘤干细胞的比例。