论文部分内容阅读
从长期受呋喃丹污染的土壤中分离到一株能以呋喃丹为唯一碳源生长的细菌，根据其生理生化特征和16S rDNA（GenBank Accession No.AY702969）同源性比较，将其初步鉴定为鞘氨醇单胞菌Shingomonas sp.，命名为CFDS-1。
研究了CFDS-1的生物学特性，CFDS-1最适生长温度30℃；最适生长初始pH6.0～7.0；装液量小于100mL/250mL时，生长良好；CFDS-1对NaCl有很高的耐受性，最适生长NaCl浓度是15g·L-1；CFDS-1对葡萄糖利用较好；以有机氮为氮源生长较好；对氨苄青霉素、链霉素有抗性。
Sphingomonas sp.CDS-1是本实验室分离到的另一株呋喃丹高效降解菌株，为了更好地了解两株降解菌的特性，对两菌株降解呋喃丹的特性进行了比较，两菌株都能降解呋喃丹生成呋喃酚，降解呋喃酚的酶被呋喃酚诱导后，能快速降解呋喃酚；两菌都能很好地降解20～300mg/L的呋喃丹，对呋喃丹的降解率和起始接种量呈正相关；CDS-1降解呋喃丹的最适pH值为6.0～7.0，CFDS-1降解呋喃丹的最适pH值为8.0～9.0；改变通气量对CDS-1降解呋喃丹没有显著影响，而当250ml三角瓶中装液量为100ml时CFDS-1降解呋喃丹效果最好；CDS-1降解呋喃丹的最适温度是30℃，CFDS-1在25℃至40℃时，都有很好的降解效果；不同的营养物质对两株菌降解呋喃丹的影响不一样。1000mg/L的葡萄糖对于二菌株降解呋喃丹的能力略有提高；土壤浸出汁可以提高CDS-1降解呋喃丹的能力，但对CFDS-1降解呋喃丹的能力基本没有影响；加入蛋白胨和酵母膏都可以提高二菌降解呋喃丹的能力。
研究了CFDS-1和CDS-1对呋喃酚的降解性能，两株菌不仅能够降解20mg/L的呋喃酚，对500mg/L的呋喃酚也有很好的降解效果；温度对CDS-1和CFDS-1降解呋喃酚影响明显，CDS-1和CFDS-1降解呋喃酚的最适降解温度分别是30℃和35℃；CDS-1降解呋喃酚的最适pH是6.0～7.0，而CFDS-1的最适pH是9.0～10.0；两菌降解呋喃酚的速率和起始接种量基本都呈正相关；在通气量好的情况下降解效果好；蛋白胨可以提高两菌的降解能力，酵母粉可以提高CFDS-1的降解能力，但对CDS-1没有影响，土壤浸出液可以提高CDS-1的降解能力，而对CFDS-1没有影响。
建立了呋喃丹水解酶（粗酶）活力的定量测定方法，研究了环境因素对其活力的影响。呋喃丹水解酶降解呋喃丹的最适反应温度为30℃，最适pH是6.5，该酶保存在20～30℃，pH大于6.0时能保持较高的酶活；该酶在极性的有机溶剂中很稳定，在非极性有机溶剂中，氯仿对该酶的活性影响最大，可以抑制40％的酶活力。在供试的13种金属离子中，当浓度为0.2mmol·L-1至2mmol·L-1时，大多数的金属离子可以提高呋喃丹水解酶的酶活，尤其是Cu+可以使酶活提高110％。酶的定域实验表明，CFDS-1中的呋喃丹水解酶主要存在于细胞内，属于胞内酶。
通过转座子插入突变法把自杀性质粒pSC123中的转座子插入到呋喃丹高效降解菌CDS-1中，经过初筛和复筛获得了六株失去降解呋喃丹功能的插入突变子。以其中一个突变子CDS-M1的基因组DNA构建文库，筛选含有转座子序列的克隆，对阳性克隆中转座子侧翼进行测序，根据测序结果（共4551个碱基）设计引物，以CDS-1的总DNA作模板进行PCR，把PCR产物先连接到pMD18-T上，根据酶切结果分析选取两个和载体不同方向连接的转化子CDT1和CDT2，再连接到广宿主载体pPZP201上，得到CDZ1和CDZ2，通过三亲结合的方法转入突变子CDS-M1中，进行功能互补实验，结果显示突变子CDS-M1中由于转入了重组质粒CDZ1后，降解功能得到了回复。表明转座子两侧的4551个碱基序列是呋喃丹水解酶相关基因。
由于CDS-1和CFDS-1在对呋喃丹和呋喃酚降解特性方面有许多不同，因此两菌可能有不同的呋喃丹水解酶基因，通过构建CFDS-1的基因组文库，以对硝基苯丁酸酯作为底物，筛选到一个能够水解对硝基苯丁酸酯到对硝基苯酚的水解酶基因，该基因由1782个碱基组成，通过在Genbank中进行核酸和蛋白质序列比对，发现和该蛋白序列同源性最高的序列来自Rhodococcus sp.MB1（GenBank accessionNo.AF173165）中的可卡因酯酶，它们具有34％的同源性，可以初步判断从CFDS-1中克隆到的对硝基苯丁酸酯水解酶基因是一个全新的基因。把该基因连接到表达载体pET29a上，在E.coli BL21实现了该基因的高效表达。从CFDS-1和E.coliBL21（DE3）-pET29a-nph的全细胞蛋白电泳图上可以看出表达菌株中存在一条表达量高且大小和理论值相一致的条带。nph在大肠杆菌中表达时不能降解呋喃丹，但是在CFDS-M1中表达时，具有降解呋喃丹的功能。
为了研究CFDS-1在土壤中的定殖情况，首先对CFDS-1进行标记，从CFDS-1的基因组DNA中获得了一个带有二个典型启动子结构的DNA片段，把含有启动子和gfp基因的DNA片段构建到广宿主载体pPZP201上，得到pPZP201-gfp，通过三亲结合的方法转入到受体菌CFDS-1，得到标记菌株CFDS-GFP。通过转座子再把linA基因插入到CFDS-GFP的染色体DNA中，从而构建了双标记菌株CFDS-GFP-LinA，该菌株同时也是一株多功能农药残留降解菌。
研究了CFDS-GFP-LinA在土壤中的降解行为，结果表明CFDS-GFP-LinA能在一周内完全降解50mg/L的呋喃丹，要比冯炘等人报道的假单胞菌AEBL3降解呋喃丹速度快。该菌在接入土壤20天后还能存活。应用平板计数法和DGGE法研究呋喃丹的使用和降解菌的施用对土壤微生物菌群数量和结构的影响，结果显示呋喃丹可以促进某类细菌的生长，真菌和放线菌的数量有所减少，但是土壤中细菌的丰富度减少；当加入降解菌CFDS-1后，这种影响作用减弱，但是土壤中细菌的菌群结构也发生了很大的变化。