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目的与背景急性肺损伤是临床上常见的急危重症,目前仍缺少十分有效的治疗措施。研究表明炎性细胞因子在急性肺损伤的发生发展及预后中具有重要的作用,抑制炎症因子的产生可以有效的减轻急性肺损伤程度,而抗肿瘤药物丁酸钠已初显其在抗炎方面的作用。本课题旨在研究丁酸钠在体外及体内的抗炎作用及其机制,为急性肺损伤的治疗提供一种新的药物。材料与方法1.采集健康人外周血,分离培养外周血单个核细胞(PBMC)。在培养PBMC的培养基中分别加入一定浓度的脂多糖(LPS)和/或丁酸钠,24小时后收集不同组别的细胞上清液。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β及IL-8的浓度,通过统计学分析丁酸钠是否抑制LPS刺激的PBMC炎性因子的产生。2.Balb/c小鼠气管内滴入LPS(1mg/kg)构建急性肺损伤(ALI)模型。构建ALI模型后,获取支气管肺泡灌洗液(BALF),采用ELISA法检测BALF中TNF-α及IL-1β的浓度;取肺组织,分别测肺湿干重比、行病理组织切片检查、ELISA法检测组织匀浆液中MPO及NO浓度。通过上述数据分析ALI小鼠模型构建成功与否。3.在小鼠气管内滴入LPS之前1h,采用灌胃法给予小鼠丁酸钠(10mg/kg)或生理盐水预处理。于小鼠接受LPS刺激后的各个时间点获取BALF,用ELISA法检测BALF中TNF-α及IL-1β的浓度;获取肺组织,分别测肺湿干重比、行病理组织切片检查、ELISA法检测组织匀浆液中MPO及NO浓度、Western Blot法检测肺组织细胞核内及胞浆核转录因子(NF)-κB的亚基NF-κBp65的表达情况。通过上述结果探讨丁酸钠在体内的抗炎作用及机制。研究结果1.体外丁酸钠的抗炎作用:PBMC在LPS刺激下TNF-α、IL-1β及IL-8均生成增多,分别达223.5±13.5 pg/ml、106.2±10.6 pg/ml和89.1±6.9 pg/ml,均较空白对照及单纯丁酸钠处理组显著增高,组间存在显著差异(p<0.05)。在给予LPS刺激前,预先行丁酸钠预处理可以显著抑制TNF-α、IL-1β及IL-8的产生,其浓度分别为130.9±10.4 pg/ml、57.7±8.6 pg/ml和48.6±5.5 pg/ml,该组与空白对照及单纯丁酸钠组间存在显著差异(p<0.05)。2.ALI小鼠模型的建立:小鼠麻醉后,经气管滴入LPS(1mg/kg)构建ALI小鼠模型。模型建立后3h,ELISA法检测ALI小鼠BALF中TNF-α及IL-1β的浓度分别为3678±16 pg/ml和638±23pg/ml,空白对照组(气管内滴入生理盐水)BALF中TNF-α及IL-1β的浓度分别为119±9 pg/ml和46±6 pg/ml,ALI小鼠模型BALF中炎性因子TNF-α及IL-1β浓度较空白对照组显著增高,存在显著性差异(p<0.05)。ELISA法检测ALI小鼠肺组织匀浆液中MPO的活性及NO的浓度分别为44.2±2.3 uIU/ml和92.8±2.4 umol/L,空白对照组肺组织匀浆液中MPO的活性及NO的浓度分别为5.5±0.8 uIU/ml和5.0±0.8 umol/L,ALI小鼠模型肺组织匀浆液中MPO活性及NO浓度较对照组显著提高,存在显著性差异(p<0.05)。ALI小鼠肺湿干重比为5.32±0.38,空白对照组肺湿干重比为4.22±0.23,ALI小鼠模型肺湿干重比较空白对照组明显增高,存在显著性差异(p<0.05)。ALI小鼠肺组织的病理学观察:广泛的肺泡壁水肿、增厚,肺泡内出血,肺泡塌陷及明显的炎性细胞浸润。空白对照组肺组织的病理学观察表现为正常的肺组织病理学特点。3.丁酸钠体内的抗炎作用及机制:ELISA法检测经丁酸钠预处理的ALI小鼠BALF中TNF-α及IL-1β在1h、3h、6h、12h及24h的浓度均较ALI小鼠模型的显著降低,存在显著性差异(p<0.05)。ELISA法检测经丁酸钠预处理的ALI小鼠肺组织匀浆液中MPO活性及NO浓度在1h、3h、6h、12h及24h较ALI小鼠模型的显著降低,存在显著性差异(p<0.05)。经丁酸钠预处理的ALI小鼠肺湿干重比较ALI小鼠模型的明显增高,存在显著性差异(p<0.05)。经丁酸钠预处理的ALI小鼠肺组织的病理学改变较ALI小鼠的轻,尤其是炎性细胞的浸润明显减少。经丁酸钠预处理的ALI小鼠肺组织细胞核内NF-κBp65的表达在1h、3h及6h较ALI的显著降低,存在显著性差异(p<0.05),而在12h和24h无显著性差异(p﹥0.05);同时胞浆内NF-κBp65的表达在3h和6h较ALI的显著增高,存在显著性差异(p<0.05),而在1h、12h和24h无显著性差异(p﹥0.05)。结论1.通过ELISA法检测细胞上清液中炎性因子的浓度,发现丁酸钠显著抑制了LPS刺激后PBMC产生的TNF-α、IL-1β和IL-8,提示丁酸钠体外抗炎作用可能主要依赖于其抑制炎性因子的产生。2.通过检测ALI小鼠模型BALF中TNF-α及IL-1β的浓度、肺组织匀浆液中MPO活性及NO浓度,观察肺组织湿干重比和病理学结果,表明LPS诱导的ALI小鼠模型的建立是成功的,为体内试验打下了基础。3.在ALI小鼠模型中,丁酸钠预处理可以明显降低小鼠TNF-α、IL-1β和NO的浓度,抑制MPO的活性,减轻肺水肿,改善肺组织病理学改变,说明丁酸钠在ALI中起到保护作用。同时,发现丁酸钠可以降低核内NF-κB的表达,提示丁酸钠可能通过抑制NF-κB的核转位,从而抑制炎性因子的释放而发挥其抗炎作用的。本研究从细胞水平及动物实验两个层面证实了丁酸钠的抗炎作用,初步阐明了丁酸钠抗炎作用的机制,为丁酸钠可能未来在ALI的应用打下了坚实的基础。