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牙周炎及根尖周炎等口腔感染性疾病影响了超过80%的成年人群。其病程中,病原体引起口腔局部炎症,刺激破骨细胞分化和活动,最终可导致牙槽骨丧失,牙齿松动,甚至牙齿缺失。近年来有研究表明,Ac45基因可作为溶骨性疾病的新型治疗靶点,而且该基因对局部免疫应答也可能有一定影响。腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)介导的RNA干扰是目前新颖有效的一种基因治疗手段,治疗后免疫反应轻微,安全性高。该研究采用携带短发夹RNA的腺相关病毒作为载体,构建以Ac45为靶点的shRNA腺相关病毒(AAV-sh-Ac45),特异性下调Ac45表达,研究其在牙周炎,根尖周炎中的牙槽骨保护作用及对局部炎症免疫反应的影响,并初步探讨其作为牙周炎和根尖周炎一种新的基因治疗的潜力。 目的:构建下调Ac45表达的AAV-sh-Ac45,通过体外及体内实验,采用完善建立的牙周炎及根尖周炎小鼠模型,研究其对牙槽骨吸收和局部炎症免疫反应的影响,为建立牙周炎及根尖周炎的基因治疗新方法提供依据。 方法:⑴构建以AAV为载体,特异性靶向Ac45的shRNA,转染体外培养的破骨细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,吖啶橙染色和F-肌动蛋白环染色检测破骨细胞的分化和酸化,通过麦胚凝集素染色和扫描电镜检测骨吸收情况。⑵通过小鼠口腔给菌,建立实验性牙周炎模型,各组小鼠分别给予AAV-sh-Ac45和AAV-sh-luc-YFP(阳性对照),并用正常未给菌小鼠作为阴性对照。第56天处死动物,收集牙槽骨样本。通过亚甲基蓝染色和HE染色检测牙周骨质吸收情况。对样本进行TRAP染色,免疫组化和免疫荧光染色,研究AAV-sh-Ac45对破骨细胞数量和功能,以及对Ac45,Cath K,CD3,F4/80等的表达的影响。采用酶联免疫吸附测定进行IL-1α,IL-6,IL-10,IL-12,IL-17A和TNF-α的表达水平的检测。实时聚合酶链式反(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)应用于分析Cath K,RANKL,OPG,TNF吨,IL-1α,IL-6和IL-17A的表达水平。⑶小鼠下颌第一磨牙开髓,疏通根管并感染细菌以建立根尖周炎模型,各组小鼠分别给予AAV-sh-Ac45和AAV-sh-luc-YFP,并用正常未开髓小鼠作为阴性对照。手术后第42天处死动物。采用Micro CT及HE染色分析根尖周病变特征及病灶区域大小。采用免疫組化和免疫荧光染色检测Ac45表达及相关免疫反应。提取根尖周炎病变的总RNA和蛋白质,检测炎性因子以及破骨细胞相关基因水平的变化。 结果:①在体外培养的破骨细胞内通过AAV介导的RNA干扰技术显著下调了Ac45表达,破骨细胞分化和酸化功能受到抑制,骨吸收显著降低。②在细菌诱导的小鼠牙周炎模型中,AAV-sh-Ac45有效感染牙周组织并下调Ac45表达,抑制了牙槽骨吸收,牙周组织内单核细胞浸润减少,树突状细胞,T细胞,巨噬细胞和破骨细胞显著减少,局部炎症反应得到抑制。牙周组织局部破骨细胞相关基因和促炎性细胞因子表达水平也显著降低。③在实验性根尖周炎模型局部给予AAV-sh-Ac45治疗,Ac45表达下调,牙槽骨丧失和炎症反应得到抑制。根尖周组织内促炎症因子如IL-1,IL-6,IL-17和TNF-α表达水平降低。 结论:在牙周炎及根尖周炎小鼠模型中,局部给予AAV-sh-Ac45作为基因治疗载体,对破骨细胞活性及功能产生影响,继而抑制炎症反应与牙槽骨吸收。