研究背景:结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。近年来,随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变,结直肠癌的发病率逐年上升。结直肠癌的治疗方式主要包括手术切除、化疗、放疗、免疫治疗等。其中,化疗是最常见的辅助治疗手段之一。然而,副作用大、肿瘤易产生耐药等问题在一定程度上限制了化疗药物的临床疗效。因此,寻找安全有效且毒副作用小的抗癌药物至关重要。铁死亡是一种新发现的程序性细胞死亡形式。不同于细胞凋亡、自噬性死亡及坏死,其发生主要是在细胞内二价铁或酯氧合酶的作用下,催化细胞膜上的不饱和脂肪酸,发生脂质过氧化,最终导致细胞死亡。研究表明,诱导细胞发生铁死亡是治疗肿瘤的一种有效策略,不仅可抑制肿瘤细胞的获得性耐药,而且可以使一些产生耐药的肿瘤细胞对铁死亡呈现出更高的敏感性。另外,代谢重编程和上皮间充质转化等肿瘤表型致使肿瘤细胞对铁死亡更加敏感。因此,诱导肿瘤细胞铁死亡广泛地被视为肿瘤治疗极具开发潜力的新策略。β-拉帕醌（β-Lapachone）是一种天然的萘醌类化合物,最早是从褐色钟花树中分离提取。β-拉帕醌具有抗真菌、抗病毒、抗炎等多种药物活性。此外,β-拉帕醌也显示出良好的抗肿瘤作用。研究发现,β-拉帕醌通过诱导肿瘤细胞内活性氧（ROS）堆积,导致肿瘤细胞发生DNA损伤,最终诱导肿瘤细胞死亡。在前期研究中,通过转录组测序和生物信息学分析,本研究发现了β-拉帕醌可能诱导结直肠癌细胞铁死亡。但,目前尚未有研究报道β-拉帕醌与肿瘤细胞铁死亡之间的相关性及其分子机制。因此,本文拟研究β-拉帕醌在结直肠癌细胞增殖、凋亡以及铁死亡中的作用,并探究β-拉帕醌诱导铁死亡的分子机制。研究目的:1.探讨β-拉帕醌在结直肠癌细胞增殖、凋亡和铁死亡中的作用;2.阐明β-拉帕醌诱导结肠癌细胞铁死亡的分子机制。实验方法:CCK-8实验检测不同药物浓度β-拉帕醌（0、1、2、4、6、8μmol/L）对正常结直肠上皮细胞（HCo Epi C）和结直肠癌细胞（SW620、SW480、DLD-1）细胞活性的影响,计算IC50值;平板克隆实验和Ed U实验检测β-拉帕醌对结直肠癌细胞增殖能力的影响。流式细胞术和蛋白免疫印迹实验检测β-拉帕醌对结直肠癌细胞凋亡的影响。通过转录组测序（RNA-seq）筛选β-拉帕醌处理后的差异表达基因,对其进行KEGG富集分析;DCFH-DA染色实验检测β-拉帕醌对结直肠癌细胞ROS生成的影响;给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1,通过CCK-8实验检测Ferrostatin-1是否部分恢复β-拉帕醌对结直肠癌细胞的抗增殖作用;丙二醛（Malondialdehyde,MDA）试剂盒检测β-拉帕醌处理后脂质过氧化产物的改变;谷胱甘肽试剂盒检测β-拉帕醌对细胞内谷胱甘肽含量的影响;蛋白免疫印迹实验检测β-拉帕醌对铁死亡标志物SLC7A11和GPX4表达的影响;给予ROS抑制剂N-Acetyl-L-cysteine（NAC）后,蛋白免疫印迹实验检测β-拉帕醌对铁死亡相关蛋白的调控作用是否被抑制。根据KEGG富集分析结果,检索富集于铁死亡信号通路中的差异表达基因,对差异表达基因进行可视化;通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验对差异表达基因进行表达验证;通过铁离子检测试剂盒分析β-拉帕醌对细胞内铁离子含量的调控作用;通过免疫荧光和蛋白免疫印迹实验验证β-拉帕醌对细胞内铁代谢及铁自噬相关蛋白表达的调节作用。通过蛋白免疫印迹和免疫荧光实验检测β-拉帕醌对自噬信号通路相关蛋白表达情况的影响;给予自噬抑制剂3-MA后,应用蛋白免疫印迹实验、MDA试剂盒和铁离子检测试剂盒,检测β-拉帕醌对铁自噬和铁代谢以及脂质过氧化中的调控作用是否被抑制。结果:1.β-拉帕醌抑制结直肠癌细胞增殖能力:CCK-8检测结果显示,不同浓度的β-拉帕醌处理24小时后,正常结直肠上皮细胞和三种结直肠癌细胞的细胞活性均呈浓度依赖性下降（p＜0.05）;平板克隆实验和Ed U核素掺入试验检测结果显示,与对照组相比,β-拉帕醌明显抑制了结直肠癌细胞的增殖能力（p＜0.01）。2.β-拉帕醌诱导结直肠癌细胞凋亡:流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,β-拉帕醌处理后结直肠癌细胞的凋亡率明显升高（p＜0.01）;蛋白免疫印迹实验结果显示,β-拉帕醌处理后细胞凋亡相关标志物Cleaved-caspase3/Pro-caspase3和Bax/Bcl-2的比值显著增加（p＜0.01）。3.β-拉帕醌促进细胞内ROS生成,诱导结直肠癌细胞铁死亡:转录组测序和KEGG富集分析结果显示,差异表达基因显著富集于P53,铁死亡,结直肠癌等信号通路;DCFH-DA染色结果显示,与对照组相比,β-拉帕醌促进了结直肠癌细胞内ROS的生成（p＜0.01）;CCK-8结果显示,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1部分逆转了β-拉帕醌对结直肠癌细胞活性的抑制作用（p＜0.01）;MDA检测结果显示,β-拉帕醌显著增加了结直肠癌细胞脂质过氧化产物丙二醛的生成（p＜0.01）;细胞内谷胱甘肽检测结果显示,β-拉帕醌处理后还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比值显著降低（p＜0.05）;蛋白免疫印迹结果显示,β-拉帕醌明显下调铁死亡相关蛋白SLC7A11和GPX4的表达水平（p＜0.01）;ROS抑制剂（NAC）部分逆转了这一结果（p＜0.01）。4.β-拉帕醌通过促进细胞内铁离子积累,诱导结直肠癌细胞铁死亡:基于转录组测序结果,实时荧光定量PCR验证差异表达基因,结果显示β-拉帕醌处理后,TFRC和LC3B表达上调（p＜0.01）,SLC3A2,,HMOX1和NCOA4表达下调（p＜0.01）,FTH1表达无明显变化;蛋白免疫印迹实验结果显示,β-拉帕醌处理后,TFRC和NCOA4表达上调（p＜0.05）,SLC3A2,HMOX1和FTH1表达下调（p＜0.05）;免疫荧光结果显示,β-拉帕醌增加了结直肠癌细胞内NCOA4的表达,抑制了FTH1的表达;铁离子检测试剂盒结果显示,与对照组相比,β-拉帕醌促进了结直肠癌细胞内二价铁离子的生成（p＜0.01）。5.β-拉帕醌通过促进铁自噬,诱导细胞铁死亡:蛋白免疫印迹结果显示,β-拉帕醌处理后,结直肠癌细胞ATG7和LC3B表达上调（p＜0.05）,P62表达下调（p＜0.05）;免疫荧光结果显示,与对照组相比,β-拉帕醌增加了结直肠癌细胞内LC3B的表达;蛋白免疫印迹结果显示,在自噬抑制剂（3-MA）处理后,部分逆转了β-拉帕醌对铁自噬相关蛋白NCOA4和FTH1的调节作用（p＜0.05）;铁离子检测试剂盒结果同样显示,3-MA预处理后,部分抑制了β-拉帕醌对结直肠癌细胞内二价铁离子的促生成作用（p＜0.01）;MDA试剂盒检测结果同样显示,3-MA预处理后,部分抑制了β-拉帕醌对结直肠癌细胞脂质过氧化产物丙二醛的促生成作用（p＜0.01）。结论:1.β-拉帕醌可抑制结直肠癌细胞增殖、诱导细胞凋亡和铁死亡。2.β-拉帕醌可通过自噬介导的铁自噬途径,使细胞内二价铁离子增加,导致结直肠癌细胞发生脂质过氧化,最终诱导结肠癌细胞铁死亡。