【摘 要】
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本实验室前期利用Tn5转座子插入突变技术获得了广藿香青枯病菌突变株,本研究以获得的突变株为供试菌株,对广藿香进行致病性试验,筛选低致病力突变株;再对这些低致病力突变株的菌落形态、生长曲线、运动性及生物膜形成能力等表型特征进行考察分析;最后,对低致病力突变株的Tn5转座子插入失活基因进行克隆,并利用qRT-PCR技术分析Tn5转座子插入失活基因在青枯菌野生菌株及突变株中的表达情况。本研究为获得分子机
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（NO.81373901）； 高等学校博士学科点专项科研基金（NO.20134425110012）；
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本实验室前期利用Tn5转座子插入突变技术获得了广藿香青枯病菌突变株,本研究以获得的突变株为供试菌株,对广藿香进行致病性试验,筛选低致病力突变株;再对这些低致病力突变株的菌落形态、生长曲线、运动性及生物膜形成能力等表型特征进行考察分析;最后,对低致病力突变株的Tn5转座子插入失活基因进行克隆,并利用qRT-PCR技术分析Tn5转座子插入失活基因在青枯菌野生菌株及突变株中的表达情况。本研究为获得分子机制明确的防治广藿香青枯病的生防菌株奠定基础。1.国内外研究评述从广藿香的种质资源与鉴定、栽培技术、主要病害及其防治三个方面论述了广藿香的相关研究现状;总结了青枯菌的致病机理包括致病因子、运动性、生物膜及成膜能力;从Tn5转座子的概况、在基因鉴定和无致病力突变株构建中的应用几个方面概述了 Tn5转座子插入突变技术的应用;介绍了植物病原菌致病基因克隆的主要方法,如根据已知序列克隆法、同源克隆法和构建基因组文库克隆法。2.广藿香青枯病菌无致病力突变株的筛选以广藿香青枯病菌野生菌株PRS-84为供试菌株,测定其生长曲线,并比较不同生长时期的青枯菌对广藿香的致病性差异,以筛选合适的致病性测定条件。以实验室前期通过Tn5转座子插入突变技术获得的突变株为研究对象,对广藿香进行致病性试验,筛选出4个致病力减弱的突变株,分别为突变株PRS-84-4-7、PRS-84-4-49、PRS-84-9-13、PRS-84-11-123。3.广藿香青枯病菌低致病力突变株的表型分析以筛选得到的4个低致病力突变株为研究对象,对其菌落形态、生长曲线、运动性及生物膜形成能力等表型进行分析。结果表明,在菌落形态上,与野生菌株相比,突变株PRS-84-4-7菌落变小、颜色变浅;突变株PRS-84-4-49无明显差异,突变株PRS-84-9-13菌落明显变小,突变株PRS-84-11-123菌落颜色变浅。在运动性上,与野生菌株相比,PRS-84-4-49运动性稍减弱,而突变株PRS-84-4-7、PRS-84-9-13、PRS-84-11-123几乎无运动性。在生物膜形成能力上,与野生菌株相比,突变株PRS-84-4-49生物膜形成能力无明显差异,而突变株PRS-84-4-7、PRS-84-9-13、PRS-84-11-123生物膜形成能力明显减弱。生长曲线分析表明,与野生菌株相比,突变株PRS-84-4-49生长无明显差异,仅在进入稳定期后OD600值降低;突变株PRS-84-4-7与PRS-84-9-13生长有所延缓,达到对数生长期时间延长;突变株PRS-84-11-123生长速度较快,明显高于野生菌株。4.青枯菌低致病力突变株Tn5转座子插入突变基因的克隆及表达分析基于突变株 PRS-84-4-7、PRS-84-4-49、PRS-84-9-13、PRS-84-11-123 的致病性减弱及表型变化,推测这4个突变株的Tn5转座子插入突变基因可能是广藿香青枯病菌的致病相关基因。分别提取基因组DNA,经过酶切、连接反应,用引物KAN-2FP-1/KAN-2RP-1进行反向PCR扩增获得各低致病力突变株的Tn5转座子插入位点侧翼序列并进行序列测定;将侧翼序列于NCBI数据库中进行Blast分析,根据同源基因序列对插入突变基因进行克隆;再利用qRT-PCR技术,分析Tn5转座子插入突变基因在突变株及野生菌株中的表达情况。结果表明,从野生菌株PRS-84中成功克隆了 4个低致病力突变株的Tn5转座子插入突变基因,生物信息学分析表明这4个基因编码蛋白分别为tRNA修饰酶MnmG、假定蛋白、能量依赖性节流蛋白EttA、氯蛋白酶。qRT-PCR结果表明,Tn5转座子插入突变基因在各低致病力突变株中的表达明显低于野生菌株。
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