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脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种给个人、家庭及社会带来巨大医疗、心理和经济负担的突发性事件。大量的研究证明,成年哺乳动物只有外周神经可以再生,中枢神经系统(central nervous system,CNS)不能再生。与外周神经和胚胎CNS相比,损伤轴突不能再生的主要原因是:残存成熟神经元内在的再生能力下降;CNS微环境中存在轴突生长抑制因子;胶质细胞增生形成的瘢痕阻碍轴突生长。近年来研究证明,当提供适当的条件后CNS能够再生,而且这些轴突的再生是由中枢神经元固有特性(intrinsic properties)和所处的微环境决定的。然而许多措施虽然可以促进轴突出芽,但由于胶质细胞形成的胶质瘢痕和抑制因子阻碍了神经的生长,再生轴突中的大部分围绕细胞或组织移植区生长,很少有神经纤维跨越损伤区而进入远端,要建立功能性轴突联系更加困难。如果能够应用药物进行干预,将是一种简单易行的方法。心肌营养素(cardiotrophin-1,CT-1)是1995年由Pennica等发现的一种细胞因子,属IL-6超家族。它具有比睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)更强的促神经元存活作用。由于CT-1受体糖蛋白130 (glycoprotein 130,gp130)与低亲和力亚基白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor receptorβ, LIFR-β)均属于细胞因子同源性受体,CT-1与gp130、LIFR-β结合后激活相关酪氨酸激酶,导致信号传导与转录活化因子磷酸化,对非神经元细胞有广泛作用,使其临床应用受限。破伤风毒素(Tetanus toxin, TeNT)是破伤风杆菌产生的,抑制脊髓运动神经元递质释放的神经毒素。它可特异地与神经元末梢结合并内在化,逆行运输至神经元,并可跨神经元间迁移。TeNT蛋白由一个重链和一个轻链组成,重链介导与神经末梢结合,轻链产生神经毒性。重链的C端片段(Tetanus toxin C Fragment, TTC)由451个氨基酸组成,能与神经特异结合并逆行运输,而没有神经毒性。因而,TTC可作为靶向神经元并逆行运输的非毒性分子,目前已有相关报道。我们设想,如果将CT-1基因与TTC基因融合,表达CT-1/TTC融合蛋白,使其同时具有与神经元特异性结合和促进神经元存活、克服CT-1对其它细胞的非特异性作用。同时,这种融合蛋白不但可在脊髓损伤局部用药,也可在脊髓特异传导束的肌肉支配区和蛛网膜下腔反复用药,通过神经特异结合并逆行运输至相应的神经元,可为脊髓损伤后的修复提供一种新的特异因子、新的给药方式。本研究主要目的在前期构建表达质粒,在DH5α表达融合蛋白,并在体外PC12细胞验证活性的基础上,拟进一步提高表达效能,在体验证基因融合表达CT-1/TTC融合蛋白的TTC片段靶向性转运大分子至脊髓神经元及被转运的CT-1片段神经营养活性。技术路线及试验方法:第一部分:pGEX-CT-1/TTC原核表达质粒载体在BL21(DE3)大肠杆菌菌株中高效表达,并纯化;1.利用冻存的大肠杆菌DH5αpGEX-CT-1/TTC菌株抽提pGEX-CT-1/TTC质粒,酶切、双酶切验证。转化至蛋白酶突变大肠杆菌BL21(DE3)菌株。挑单克隆菌落在37℃下震摇过夜,抽提质粒,酶切再次鉴定,两次酶切结果提示在预期条带大小出现目的条带,表达菌株构建成功。2.利用将BL21(DE3) pGEX-CT-1/TTC经过IPTG诱导在不同诱导时间、不同温度优化表达,超声裂菌,离心,对各组上清和沉淀行SDS-PAGE蛋白电泳,分别用考马斯亮蓝和WB方法验证目的蛋白表达结果。第二部分:分析CT -1/TTC融合蛋白靶向性转运活性;制备SD大鼠坐骨神经损伤模型(离断性),将实验动物单纯随机分为正常对照组、损伤对照组、坐骨神经再生室给药组、肌肉注射给药组,自由放养一周,灌注固定取脊髓腰膨大,冰冻切片,免疫组化检测。观察靶向性转运CT 1/TTC融合蛋白阳性脊髓前角运动神经元细胞。第三部分:分析CT -1/TTC融合蛋白神经营养活性;制备6～7天新生SD大鼠坐骨神经损伤动物模型,将动物分为正常对照组、损伤对照组、给药组。自由放养一周,灌注固定取脊髓腰膨大,冰冻切片。尼氏染色,计数脊髓前角运动神经元并成对t检验统计分析。主要结果及结论:1.将pGEX-CT-1/TTC转化入表达载体BL21(DE3)菌株;2.优化得到目的蛋白的表达条件,于35℃5h诱导表达效能高;3.纯化获得2.7mg/ml的CT-1/TTC融合蛋白,总量共计约15mg;4.坐骨神经再生室给药组、肌肉注射组SD成年大鼠在脊髓腰膨大前角运动神经元检测到目的蛋白;5.于6～7天SD大鼠坐骨神经损伤后,t检验统计给药组与正常对照组、损伤对照组存在显著性差异。