毛竹CPA家族的鉴定及PheNHX2的功能分析

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毛竹(Phyllostachys edulis)是世界上最重要的非木材林产品之一,具有较高的文化、生态和经济价值,而低温、干旱、盐渍等众多不利环境因素却严重制约着毛竹产业的发展,因此,如何利用分子生物学技术挖掘毛竹中的抗逆基因,提高毛竹对非生物胁迫的耐受性成为毛竹遗传育种的重要课题。植物单价阳离子/质子反转运蛋白(CPA)是一类在植物盐胁迫响应中起重要作用的跨膜转运蛋白,包括Na+/H+逆向转运蛋白(NHX),K+外排转运蛋白(KEA)和阳离子/H+交换蛋白(CHX)。目前CPA已在其他多个物种被分离鉴定,然而毛竹CPA的分子特征尚不明晰。在本研究中,首先利用生物信息学方法在全基因组水平鉴定了毛竹CPA,随后通过运用qRT-PCR技术分析了毛竹NHX基因的组织和诱导表达模式,筛选出抗逆候选基因PheNHX2,并进一步利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达PheNHX2以研究该基因的生物学功能。获得以下主要结果:1.在毛竹基因组中鉴定出37个含Na_H_Exchanger(PF00999)结构域的CPA,系统发育分析表明毛竹CPA可分为三类:10个NHX(PheNHX1-PheNHX10),6个KEA(PheKEA1-PheKEA6)和21个CHX(PheCHX1-PheCHX21)。在毛竹CPA蛋白中预测出10个保守基序,其中属于Na_H_Exchanger结构域片段的基序Motif2高度保守,分布于所有的毛竹CPA成员。2.毛竹NHX的组织表达模式分析表明,这些基因在多个组织中特异性表达;诱导表达模式分析表明,盐处理对毛竹NHX的表达有不同程度的诱导作用,其中PheNHX2在NaCl处理下的表达显著上调。3.PheNHX2的亚细胞定位实验表明PheNHX2是一类液泡膜定位蛋白。过表达PheNHX2转基因拟南芥在盐胁迫下,显著抑制了植物种子发芽和根系生长,影响了细胞中的Na+和K+平衡,降低了转基因拟南芥的耐盐性。同时包括叶绿素含量,丙二醛含量,过氧化物酶、过氧化氢酶活性以及相对电导率等相关生理指标的测定,进一步证实了过表达PheNHX2降低了转基因拟南芥的耐盐性。qRT-PCR实验结果表明,在盐胁迫下,过表达PheNHX2显著抑制了转基因拟南芥中一些与胁迫及离子转运相关的基因的表达。毛竹NHX是一类与植物盐胁迫响应相关的基因,其中液泡膜定位的PheNHX2对植物的耐盐性呈负调节。研究结果为毛竹CPA基因功能和PheNHX2调控毛竹耐盐性机制研究奠定了基础。
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