研究目的: 利用基因工程技术表达宿主(大鼠)源性和寄生虫(日本血吸虫和华支睾吸虫)源性IgE依赖HRF，验证3种重组蛋白(rRttRF、rCsttRF和rSjHRF)的免疫交叉反应性，体外实验观察3种重组蛋白刺激宿主致敏肥大细胞释放组胺的功能，以及抗虫源性IgE依赖HRF的特异性抗体对宿主源性IgE依赖HRF生物学功能的影响，为蠕虫感染影响超敏反应性疾病发生的分子机制提供实验依据。 研究方法: 1、根据GenBank中已知的大鼠IgE依赖HRF(RHRF)mRNA序列设计引物，以Wistar大鼠肝组织中提取的总RNA为模板，通过RT-PCR扩增RHRF‘全长cDNA序列，并通过TA克隆、蓝白斑筛选和序列测定鉴定PCR产物序列是否正确；采用PCR方法分别从华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库及已构建的pGEX-4T-1-SiTCTP重组质粒中扩增CsHRF cDNA和sjHRF cDNA。 2、运用生物信息学方法对RHRF cDNA、CsHRF cDNA和sjHRF cDNA推导氨基酸序列的各级结构进行分析和比较，包括氨基酸序列同源性比较、分子进化分析、功能域预测、二级结构分析、抗原表位分析、空间构象预测等，评价三者在各级结构中的相似性。 3、将RHRF cDNA克隆至原核表达载体pET-28a(+)及pET-30a(+)：将CsHRF cDNA和SiHRF cDNA分别克隆至原核表达载体pET-30a(+)；通过PCR、双酶切及序列测定对各重组质粒进行鉴定。 4、将各重组质粒转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导，获取原核表达的可溶性重组蛋白rRHRF、rCsHRF和rsjHRF，并利用亲和层析方法进行纯化。 5、将纯化的rCsHRF和rsjHRF分别免疫Wistar大鼠，制备免疫血清；利用Protein G树脂通过亲和层析方法分别纯化2种免疫血清中的总IgG。 6、利用ELISA和Western Blotting分析重组蛋白rRHRF、rCsHRF和rsjHRF的免疫交叉反应性。 7、以氢氧化铝为佐剂，用鸡卵清蛋白(OVA)致敏Wistar大鼠；采用I型胶原酶和透明质酸酶消化法，对大鼠肺组织中的致敏肥大细胞进行原代分离和培养。 8、运用荧光分光光度法检测3种重组蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF及致敏原OVA诱导致敏肥大细胞释放组胺的剂量依赖关系，所用浓度梯度为101μg/ml，501μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml。 9、运用荧光分光光度法检测3种重组蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF诱导致敏肥大细胞释放组胺与时间的关系，所观察的反应时间分别为5min、15 min、25min、35min、45min。 10、运用荧光分光光度法检测纯化后的抗rCsHRF IgG和抗rSjHRF IgG对重组蛋白rRHRF诱导致敏肥大细胞释放组胺的影响，每种抗体所用体积百分比浓度为1/5，2/5，3/5。 研究结果: 1、采用RT-PCR及TA克隆筛选，获得了RHRF全长cDNA，采用PCR扩增得到了CsHRF和sjHRF全长cDNA。其中RHRF cDNA全长516bp，推导氨基酸序列长172aa；CsHRF cDNA和SjHRF cDNA长度均为507 bp，推导氨基酸序列长169aa。 2、生物信息学分析表明，RHRF、CsHRF和SjHRF cDNA推导氨基酸序列的预测分子量分别为19596.4 Da，19331.0 Da，19375.7 Da，理论等电点依次为4.99，5.06，4.73。多物种HRF氨基酸序列同源性比较，发现了14个完全一致的氨基酸残基：1(M)，11(D)，12(E)，55(E)，72(D)，79(L)，94(Y)，96(K)，144(G)，145(E)，170(P)，176(K)，182(E)，183(K)；分子进化分析显示RHRF氨基酸序列与小鼠HRF亲缘关系最近，与人HRF具有相同起源，CsHRF与SjHRF亲缘关系最近，且两者与脊椎动物HRF的亲缘关系高于与无脊椎动物(果蝇、虾、秀丽杆线虫)及单细胞恶性疟原虫的亲缘关系，说明日本血吸虫与华支睾吸虫的IgE依赖HRF可能与宿主的IgE依赖HRF存在协同进化现象。RHRF与CsHRF氨基酸序列的一致性为43﹪，RHRF与sjHRF氨基酸序列的一致性为38﹪，CsHRF与SjHRF氨基酸序列的一致性为61﹪。三者均属于TCTP家族(IPR001983)，含有基本相同的结构域；三者所含二级结构的类型完全相同，且各种二级结构在分子中所占比例极为相似；三者的空间构象基本一致，尤其是0L螺旋区均具有保守的线性表位。 3、成功构建了RHRF、CsHRF和SjHRF cDNA的原核表达载体pET-28-rRHRF、pET-30-rRHRF、pET-30-rCsHRF及pET-30-rSjHRF，各重组蛋白均在转化大肠杆菌BL21获得表达，但可溶性表达水平不一，经亲和层析方法获得了纯化的可溶性重组蛋白rRHeF、rCsHRF和rSjHRF。 4、ELISA和Western Blotting证实重组蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF三者之间存在免疫交叉反应性，且rRHRF/rCsHRF及rPHRF/rSjHRF之间的免疫交叉反应性主要由构象表位决定，线性表位介导的交叉反应较弱。 5、重组蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF诱导致敏肥大细胞释放组胺具有剂量依赖关系：当重组蛋白浓度从10μg/ml上升至150μg/ml过程中，致敏肥大细胞组胺释放率随之上升；但当重组蛋白浓度达到200μg/ml时，部分实验中致敏肥大细胞组胺释放率反而有所下降；rRHRF诱导致敏肥大细胞释放组胺的能力高于rCsHRF和rSjHRV，但低于变应原OVA。 6、重组蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF诱导致敏肥大细胞释放组胺的动力学曲线显示：3种重组蛋白诱导致敏肥大细胞组胺释放率随着时间延长而增加，在反应开始后35min左右组胺释放率达到最高；达到50﹪最大组胺释放率时间约需15～20min。 7、不同浓度(1/5，2/5，3/5)的纯化抗rCsHRF IgG和抗rSjHRF IgG可以部分抑制重组蛋白rRHRF(75μg/ml)诱导致敏肥大细胞释放组胺的功能，但抗体抑制作用的强弱与抗体滴度之间是否存在剂量依赖关系还需进一步验证。 结论： 1、寄生虫IgE依赖HRF与宿主IgE依赖HRF的氨基酸序列一致性虽然不高，但具有非常相似的空间结构，三种重组蛋白的免疫交叉反应性证实了其结构的相似性，这种交叉反应主要由抗原的构象表位决定。 2、rRHRF、rCsHRF和rSjHRF诱导大鼠致敏肥大细胞释放组胺具有剂量依赖关系，虫源性rCsHRF和rSjHRF可以模拟宿主内源性rRHRF的生物学功能， 抗虫源性IgE依赖HRF的抗体对宿主内源性IgE依赖HRF的生物学效应具有抑制作用，提示三者可能通过相同的功能域发挥效应，具有共同的作用机制。 3、本研究初步证实了寄生性蠕虫感染可通过释放虫源性IgE依赖HRF调节宿主I型超敏反应的发生发展过程，为哮喘等I型超敏反应性疾病的预防和治疗提供了新的思路。