流感病毒是引起人类急性呼吸道感染疾病的主要病因,人类普遍易感。由于流感病毒易发生抗原变异,每年都可在全球发生季节性的流行。流感每年可引起全球大约5%-20%人群感染,导致300-500万重症病例和25-50万死亡病例。20世纪人类历史曾记载过三次流感大流行,其中1918年的西班牙流感最为严重,导致全球近三分之一人口的感染,死亡人数达5000万。世界卫生组织(WHO)从1957年起就开始对流感病毒的流行进行全球化监测,以应对随时可能出现的流感暴发和大流行。流感病毒根据其核蛋白的不同可以分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中甲型流感病毒的致病力最强,也更容易引起较为严重的疾病,乙型流感病毒只能感染人类,致病性相对较低,丙型流感病毒很少造成流行,往往只是在儿童中引起轻微的上呼吸道感染。国外的研究显示儿童是流感病毒的易感人群,也是社区传播流感病毒的主要人群。而且,儿童流感可更易发生并发症,导致更高的住院率和疾病负担。但是国内及上海地区鲜有儿童流感的流行病学监测报道。流感病毒监测的主要内容包括流行趋势、流行株的抗原进化和变异以及耐药性。基于儿童流感的重要性以及国内儿童流感研究的差距,以及2009年6月起全球进入新型甲型H1N1流感大流行的背景,我们于2009年6月-2012年5月对上海地区儿童流感进行分子流行病学监测研究,对本地区儿科人群中流感病毒流行株的血凝素(Hemagglutinin, HA)、M2基质蛋白和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)片段的相关位点进行基因序列分析,研究本地区儿童流感病毒抗原进化规律,监测本地区儿童流感病毒对抗病毒药物的耐药现况。为本地区儿童流感的合理防治提供科学依据。第一部分2009年6月-2012年5月上海地区儿童流感的流行趋势目的：了解2009年6月-2012年5月上海地区儿童流感病毒的流行特征,为儿童流感防治策略提供依据。方法：我们前瞻性地搜集2009年6月至2012年5月期间复旦大学附属儿科医院门诊因流感样疾病就诊患儿的鼻咽拭子或者咽喉拭子标本,采用一步法实时荧光定量RT-PCR检测季节性甲型H3N2和H1N1病毒、乙型流感病毒以及新型甲型H1N1流感病毒。结果：连续三年共有3475例患儿入选,其中978(28.1%)例被确诊感染流感病毒。978份流感病毒阳性标本中,甲型流感病毒阳性共577(59.0%)份,包含344份季节性甲型H3N2、222份新型甲型H1N1和4份季节性甲型H1N1(其中3份为新型甲型H1N1与季节性甲型H3N2混合感染),此外还包含7份甲型流感病毒未分出亚型的标本,乙型流感病毒阳性共有421(43.0%)份；其中20(2.0%)份为甲型和乙型流感病毒均检测阳性的标本。结论：2009年6月至2012年5月期间,上海地区每年都会发生流感病毒在儿童中暴发流行,流行季节可以发生在秋季、冬季和春季,季节性甲型H3N2、新型甲型H1N1及乙型流感病毒交替流行。为了更好的防治儿童流感,我们建议流感疫苗在秋季入学前接种。第二部分上海地区儿童甲型H3N2流感病毒的抗原进化规律和耐药研究目的：监测甲型H3N2病毒株的血凝素((hemaagglutinin, HA)抗原位点进化规律以及对抗病毒药物的耐药情况。方法：根据时间分布随机选取71株甲型H3N2病毒的,对其HA1片段、M2基质蛋白和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)部分片段进行基因测序。与疫苗株比较分析HA抗原位点的基因进化特征,检测M2和NA介导抗病毒药物耐药的氨基酸位点突变标志。结果：与当季疫苗株相比,每年甲型H3N2流行株至少发生3个HAl抗原决定区域相关氨基酸位点的突变,系统进化树显示不同季节流行株分属于不同谱系(Clade),新的谱系往往在当季流行的高峰临近结束时出现。71株甲型H3N2病毒均携带介导对金刚烷胺耐药的S31N突变标志,未发现甲型H3N2病毒株携带对奥司他韦耐药的分子标志。结论：甲型H3N2流感病毒的HA抗原区域存在持续的氨基酸位点突变,可能引起流行株抗原性发生变化,导致人群中暴发流行,影响季节性疫苗的保护效果。甲型H3N2流感病毒对金刚烷胺的耐药率已达100%,尚未发现奥司他韦耐药株,不宜再使用含有金刚烷胺的药物来防治流感。第三部分上海地区儿童新型甲型H1N1流感病毒的抗原进化规律和耐药研究目的：监测新型甲型H1N1流感病毒HA抗原区抗原位点变异及其基因进化,以及携带H275Y突变特征的奥司他韦耐药株。方法：根据时间分布随机选取37株新型甲型H1N1病毒株,对其HA1片段和NA部分片段进行基因测序。与疫苗株比较分析HA抗原位点的基因进化特征,检测介导奥司他韦耐药的氨基酸位点突变标志。结果：新型甲型H1N1病毒HA序列分析显示上海地区流行株与疫苗株高度同源,仅发现E区抗原位点S83P突变。未检测到NA基因片段具有H275Y和N295S特征突变的奥司他韦耐药株。结论：上海地区儿童在2009-2011年经历了2次新型甲型H1N1流感的暴发流行波以后,2012年未出现流行。上海地区流行的新型甲型H1N1与疫苗株抗原位点高度同源,尚未发现奥司他韦耐药株。第四部分上海地区儿童乙型流感病毒的抗原进化规律和耐药研究目的：了解2009年5月至2012年6月上海地区儿童乙型流感病毒的流行谱系,监测其HA抗原位点的分子突变以及与奥司他韦耐药有关的变异株流行情况。方法：随机选取55株乙型流感病毒代表株进行HA和NA基因测序,从GENEBANK上下载不同区域和不同时间乙型流感流行株的HA基因序列,构建分子进化树。用MEGA4.0软件邻接法(Neighbor-Joining NJ)绘制系统进化树。结果：55株乙型流感病毒中有36株属于Victoria系,19株为Yamagata系。Victoria系分为两个Clade A和Clade B两个谱系,Clade A以B/Malaysia/2506/04为代表,主要包括2009年-2010年的流行株,Clade B以疫苗株B/Brisbane60/08为代表,主要包括2010-2012流行株。而Yamagata系所有的病毒株抗原性与B/Florida/4/06相似。在55株乙型流感病毒株中,未检测到携带奥司他韦耐药的分子标志。结论：乙型流感病毒存在Victoria系和Yamagata系共同流行,尚未发现乙型流感病毒对奥司他韦耐药。