食品小分子危害物的适配体Capture-SELEX筛选与检测研究

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食品中小分子危害物的残留污染所带来的一系列影响人类健康的问题一直是全球关注的焦点。近年来,一些不需要使用大型仪器的免疫分析技术和具有生物活性的小分子识别探针在食品小分子危害物的检测中发挥着重要的作用。核酸适配体(aptamer)是一种新型生物识别分子,和抗体相比,在实现特异性识别小分子危害物的同时,还具有易大量合成且性质稳定的优点。但目前关于高效氯氟氰菊酯和氨基甲酸乙酯的适配体筛选研究还未见报道。本论文着眼于Capture-SELEX筛选技术,针对该筛选策略作进一步的改进,并利用这个技术筛选能特异性识别高效氯氟氰菊酯和氨基甲酸乙酯的核酸适配体,最后围绕核酸适配体开展性能鉴定和初步的检测分析。主要的研究结论如下:(1)本文我们首次提出了通过随机ss DNA文库固定化,采用改进过后的Capture-SELEX技术筛选高效氯氟氰菊酯农药适配体的筛选策略。首先我们通过生物素-亲和素作用将文库固定在纳米磁珠表面,随后加入高效氯氟氰菊酯孵育以捕获亲和性序列,经过14轮筛选得到能特异性识别高效氯氟氰菊酯的核酸适配体并命名为LCT-1,其Kd值为50.64±4.33 nmol·L-1。分子对接技术(Molecular Docking)分析发现高效氯氟氰菊酯农药小分子与适配体LCT-1主要依靠疏水相互作用和氢键作用力发生稳定的结合。接着,本文将亲和序列LCT-1截短并将截短序列命名为LCT-1-39,经过分析得知高效氯氟氰菊酯小分子通过疏水相互作用结合在LCT-1-39适配体三维结构的疏水腔中,其中碱基G-10与高效氯氟氰菊酯小分子形成稳定氢键,两者的最低结合自由能为-8.1 kcal·mol-1。高效氯氟氰菊酯与LCT-1-39适配体结合解离常数为10.27±1.33 nmol·L-1。(2)本文采用Capture-SELEX技术筛选氨基甲酸乙酯适配体,经过12轮筛选得到能特异性识别氨基甲酸乙酯的核酸适配体并命名为EC1,其Kd值为49.75±9.42nmol·L-1。采用分子模拟软件构建适配体EC1与氨基甲酸乙酯小分子的结合模型,氨基甲酸乙酯小分子通过疏水相互作用结合在EC1适配体三维结构的疏水腔中,并被侧链碱基G-8、T-9、A-26、G-28、和G-29包围,其中G-8、G-28和G-29碱基与氨基甲酸乙酯小分子之间存在氢键作用,这些特定的碱基结构和分子间作用力使氨基甲酸乙酯小分子与EC1能够稳定的结合在一起。(3)以LCT-1和LCT-1-39核酸适配体作为识别分子,创建了基于阳离子化合物PDDA介导Au NPs聚集的比色检测高效氯氟氰菊酯农药的生物传感器,其最低检测限分别为0.0197μg·m L-1和0.0186μg·m L-1,实验证实该方法具有较好的可重复性和重现性,可用于快速检测果蔬产品中高效氯氟氰菊酯残留污染。综上所述,本文对课题组前期发明的Capture-SELEX技术作了进一步的改进,并将其成功用于筛选特异性识别高效氯氟氰菊酯和氨基甲酸乙酯小分子的核酸适配体。本项工作不但为农产品和食品中的高效氯氟氰菊酯和氨基甲酸乙酯残留检测提供新思路,而且进一步拓展了核酸适配体技术在小分子危害物检测的应用范围,同时也为其它食品小分子危害物的核酸适配体筛选提供借鉴和技术支撑。
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