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【目的】以汉坦病毒SEO型L99株S基因的重组株E.coli BL21(DE3)/pET32a-L99S为研究对象,进行优化表达、纯化其编码的重组核蛋白(rNP),并制备免疫血清,建立免疫学方法用于检测病人的血清抗体和动物肺组织中的抗原。【方法】1.优化E.coli BL21(DE3)/pET32a-L99S的rNP表达条件,观察3个因素(温度、时间、IPTG浓度)18个条件对rNP表达情况的影响,用SDS-PAGE分析目的蛋白的浓度、占菌体总蛋白的百分含量及溶解情况。2.E.coli BL21(DE3)/pET32a-L99S超声破碎后,包涵体经洗涤和增溶,取其上清部分进行镍亲和层析纯化,收集目的蛋白峰,进一步透析和浓缩后将所获纯化蛋自经SDS-PAGE分析纯度并用Bradford法测定其浓度,用Western-blot鉴定其抗原性。3.用纯化的rNP免疫日本大耳白兔,制备免疫血清,ELISA测定血清效价,Western-blot鉴定其免疫原性。4.纯化的rNP用于三种不同的ELISA:rNP-ELISA、HRP-rNP-ELISA和免疫磁性微球ELISA(IMMS-rNP-ELISA),选用HFRS病人阳性血清和健康人血清,比较不同方法的灵敏度和特异度。5.分别以兔rNP抗血清和HFRS病人混合血清为一抗用于间接免疫荧光法(IFA)检测59份鼠肺组织标本中的HV抗原。将两种IFA检测结果不一致的鼠肺标本采用RT-nested-PCR比较其结果。【结果】1.确定rNP表达的最佳条件,即IPTG 0.5 mmol/L、30℃诱导5h,其表达量可达626.04μg/ml,占菌体总蛋白的52.2%,表达产物主要以包涵体形式存在。2.超声处理后,用镍亲和层析纯化rNP,在连续梯度洗脱中收集咪唑浓度在250-300 mmol/L的洗脱液,所获rNP纯度达95%以上,蛋白浓度为18.01mg/ml,总回收率为28.9%,提纯倍数1.83,Western-blot显示纯化蛋白与HFRS病人血清反应有良好的抗原性。3.纯化rNP制备抗血清,抗体效价达512 000以上。Western blot显示:纯化的rNP与兔rNP抗血清反应条带单一。4.三种ELISA检测病人血清IgG抗体,rNP-ELISA,HRP-rNP-ELISA法和IMMS-rNP-ELISA的灵敏度分别为100%、92.5%、100%,特异度分别为95%、100%、100%。5.用两种IFA检测59份鼠肺冰冻切片的HV抗原,一抗为兔rNP抗血清的IFA有14份阳性,占23.7%;一抗为患者混和血清的IFA有10份阳性,占16.9%。兔rNP抗血清IFA的切片背景清晰,易于判断。将上述两种IFA检测结果不一致的6份鼠肺标本进行RT-nested-PCR,均与兔rNP抗血清IFA的结果相一致。【结论】1.确定了重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-L99S的rNP最佳表达和纯化条件。2.以纯化的rNP作为抗原,建立了rNP-ELISA、HRP-rNP-ELISA和IMMS-rNP-ELISA检测病人血清HV IgG抗体,灵敏、特异、方法简便、易于推广。3.用纯化rNP制备兔免疫血清,用于鼠肺组织HV抗原的检测,具有很好的应用前景。