【摘 要】
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第一部分绝经后骨质疏松患者骨细胞发生程序性坏死目的:分析不同阶段患者骨细胞发生程序性坏死和凋亡的细胞阳性率,探讨不同阶段患者骨细胞是否发生程序性坏死,以及程序性坏死和凋亡在不同阶段中的表达是否存在差异,以明确程序性坏死是绝经后骨质疏松患者骨细胞死亡中的一种重要方式。方法:1.按照国际临床骨密度学会认定的双能X线吸收测定法（dural X-ray absorptiometry,DXA）,对2020年
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第一部分绝经后骨质疏松患者骨细胞发生程序性坏死目的:分析不同阶段患者骨细胞发生程序性坏死和凋亡的细胞阳性率,探讨不同阶段患者骨细胞是否发生程序性坏死,以及程序性坏死和凋亡在不同阶段中的表达是否存在差异,以明确程序性坏死是绝经后骨质疏松患者骨细胞死亡中的一种重要方式。方法:1.按照国际临床骨密度学会认定的双能X线吸收测定法（dural X-ray absorptiometry,DXA）,对2020年1月至2021年1月于海南医学院第一附属医院行髋关节置换的绝经后患者进行骨密度检测,根据骨密度检测的T值,将患者分为骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组和重度骨质疏松组。2.结合纳入标准和排除标准,每组纳入15例,共60例。收集患者临床资料和术后股骨Ward’s三角骨组织。将每一例患者骨组织制成HE染色、透射电镜、免疫荧光、免疫组化四种类型实验标本。3.将各组HE染色标本在普通光学显微镜下依次观察骨组织中骨小梁微结构。4.将各组电镜标本依次进行透射电子显微镜,观察骨细胞形态学。5.将各组免疫荧光标本依次进行免疫荧光实验,检测骨细胞中程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL的表达,以及应用TUNEL+cleaved Caspase-3检测凋亡标志性蛋白的表达。6.将各组免疫组化标本依次进行免疫组化实验,检测骨组织中程序性坏死标志性蛋白RIP3的表达,以及凋亡标志性蛋白cleaved Caspase-3的表达。结果:1.HE染色后镜下观察骨组织骨小梁微结构变化,可见绝经后患者随着骨质疏松程度的加重,骨小梁变细甚至断裂,骨小梁间隙距离也逐渐增大。2.透射电子显微镜发现,骨质疏松组和重度骨质疏松组中骨细胞可见有呈现典型的坏死形态学特征:整个细胞和细胞器发生明显肿胀,细胞膜严重破坏,胞浆内容物溢出,伴有细胞内广泛囊泡的形成;但骨量正常组和骨量减少组中骨细胞未见典型的坏死形态学特征。3.免疫荧光和免疫组化结果显示:（1）骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组和重度骨质疏松组中RIP1、RIP3、MLKL、cleaved Caspase-3蛋白于骨细胞胞浆均有表达,且骨质疏松组和重度骨质疏松组RIP3阳性（程序性坏死细胞）和cleaved Caspase-3（凋亡细胞）百分率较骨量正常组明显增高（P＜0.01）。（2）在骨质疏松组和重度骨质疏松组中,RIP3阳性百分率较cleaved Caspase-3阳性百分率高（P＜0.05）。结论:1.绝经后骨质疏松发病过程中,骨细胞可能在骨质疏松和重度骨质疏松阶段发生程序性坏死。2.在绝经后骨质疏松和重度骨质疏松阶段,程序性坏死较凋亡可能发挥着更重要的作用。第二部分绝经后骨质疏松患者骨细胞RANKL蛋白表达上调,导致骨质疏松的进一步发生、发展目的:分析绝经后患者骨细胞中RANKL蛋白和OPG蛋白的表达,探讨雌激素缺乏时发生程序性坏死的骨细胞是否通过上调RANKL,使RANKL/RANK/OPG系统失衡,进而导致绝经后骨质疏松的进一步发生、发展。方法:1.将各组免疫荧光标本依次进行免疫荧光实验,检测骨细胞中RANKL、OPG蛋白的表达。2.将各组免疫组化标本依次进行免疫组化实验,检测骨细胞中RANKL、OPG蛋白的表达。3.采用Pearson相关性检验分析骨细胞程序性坏死率与RANKL、OPG的相关性。结果:1.免疫荧光和免疫组化结果显示:骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组和重度骨质疏松组中RANKL、OPG蛋白于骨细胞胞浆中均有表达,且随着骨质疏松程度的加重RANKL蛋白表达逐渐上升,OPG蛋白表达逐渐下降。2.Pearson相关分析结果显示,骨细胞程序性坏死百分率与RANKL呈正相关,r为0.834;与OPG呈负相关,r为-0.566。结论:绝经后骨质疏松发病过程中,发生程序性坏死的骨细胞可能通过上调RANKL,使RANKL/RANK/OPG信号通路失衡,导致绝经后骨质疏松进一步发生、发展。
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