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碱性蛋白酶是一类可在碱性条件下将蛋白质水解为小分子肽和氨基酸的酶,广泛应用于食品、医药、洗衣和皮革等行业中。近年来,随着人们的环保意识日渐增强,工业上提倡使用环境友好型生产工艺,为碱性蛋白酶的推广应用创造了有利的条件。寻找能用于工业化生产的碱性蛋白酶高产菌株,降低生产成本,建立起碱性蛋白酶的生产体系是形势所趋。所以,为了提升我国的碱性蛋白酶的品质和扩大碱性蛋白酶的应用,筛选高产碱性蛋白酶的优良菌株,并进行酶学性质研究,仍然是实现其产业化生产和应用的一条必不可少的重要途径。本论文以从本校栽植多年的桃树,草地,丛林和垃圾堆等周围土壤中筛选出产碱性蛋白酶能力较好的耐热型芽孢杆菌ZJ1502为研究对象,对它进行了菌种鉴定、发酵产酶培养条件的优化、所产碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质的研究,旨在为其实际应用提供理论基础。1.首先利用在脱脂牛奶筛选平板上产生透明圈的大小进行了产碱性蛋白酶菌株的初筛,然后采用以酪蛋白作为底物的Folin-酚法进行了菌株的复筛,获得了一株碱性蛋白酶酶活性较高的菌株,并命名为ZJ1502。经形态学观察、生理生化鉴定以及16S rRNA分子生物学分析,确定菌株ZJ1502为芽孢杆菌属中的韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)。2.为了提高芽孢杆菌ZJ1502产碱性蛋白酶的酶活力,在原始发酵培养基的基础上,以酶活力的大小作为指标,首先通过单因素试验考察了碳源、氮源、金属离子、温度、接种量和pH等对筛选菌株所产碱性蛋白酶酶活力的影响,进一步采用Plackett-Burman试验设计筛选出3个具有显著影响效应的影响因子,分别为酵母粉、葡萄糖和pH;最后通过Box-Behnken试验设计和响应面分析确定了显著影响因子的最佳水平,得到芽孢杆菌ZJ1502发酵生产碱性蛋白酶的最佳培养基组成为:酵母膏6%、葡萄糖5.61%、K2HPO4 0.9%、KH2PO40.2%、MgSO40.4%;最佳发酵参数为:初始pH8.94、接种量6%、温度37℃、装液量50 mL/250 mL。在上述条件下,芽孢杆菌ZJ1502发酵36 h后,碱性蛋白酶的活力高达153.04 U.mL-1。与未优化前相比,提高了 3.77倍。3.在最佳发酵培养条件下,将发酵液经过硫酸铵盐析、透析除盐、PEG20000浓缩、DEAE-52纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析,对芽孢杆菌ZJ1502所产的碱性蛋白酶进行了分离纯化,最终获得的酶液的纯化倍数为18.57,回收率为7.13%,碱性蛋白酶的分子量约为14.3 kDa。4.对分离纯化后的碱性蛋白酶的酶学性质进行了研究,该碱性蛋白酶酶的最适反应温度为40℃,最适pH为10.0,pH稳定范围为9.0-11.0,具有良好的耐热性和耐碱性;金属离子对碱性蛋白酶酶活力均具有不同程度的影响,其中Mn2+对碱性蛋白酶酶活有明显的激活作用;SDS和EDTA对碱性蛋白酶的酶活力有抑制作用,并且随着其浓度的增加,抑制作用越明显;吐温-60,Triton X-100对其酶活力基本无影响;吐温-80对碱性蛋白酶的酶活力有促进作用;与金属离子表面活性剂相比,非金属离子表面活性剂对酶活性影响较小,甚至有激活作用。另外,纯化的碱性蛋白酶在正丁醇、乙醇等有机溶剂中耐受力比较差,但在甘油和油酸中酶活力有着显著的提高;碱性蛋白酶的最适作用底物为酪蛋白。该蛋白酶不能水解明胶和胶原蛋白,可水解部分牛血清白蛋白;并且该酶在0.5 mol/L H2O2溶液中表现出一定的耐氧化能力,其米氏常数Km为16.7 mg/mL,Vmax为14.71μg/(min·mL)。该碱性蛋白酶良好的热稳定性和耐碱性表明了它具有潜在的研究和应用价值。