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流行性感冒每年都会产生季节性流行,对所有人群普遍易感,传播迅速,严重威胁着人类的健康。接种疫苗是预防流感病毒性流行的重要方式。现在上市使用的流感疫苗普遍为皮下或者肌内接种,接种耐受性差、免疫效果差。为了增加疫苗接种的依从性和免疫效果,人们将流感相关疫苗的接种方式转向了鼻黏膜接种。鼻黏膜接种不仅易于操作无痛,而且由于模拟了流感病毒感染机体的途径,产生的免疫效果更加全面。但是,由于鼻腔表面黏膜的屏障保护作用,单纯的流感病毒抗原并不能很好地穿过鼻黏膜引起机体免疫应答。因此,人们需要寻找新的鼻黏膜佐剂来辅助流感抗原发挥免疫效果。课题组前期研究也发现,将水溶性硫酸化可德兰多糖(curdlan sulfate,CS)与6-O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(OHTCC)通过静电结合形成纳米粒能够活化抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs),刺激 NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子的表达,引起交叉递呈。将纳米粒荷载模式抗原(ovalbumin,OVA),对小鼠滴鼻给药后,能够引起APCs的活化和递呈,增加T细胞的数量,引起全身系统性免疫应答以及局部黏膜免疫应答,是很好的候选佐剂。但是其存在现配现用、稳定性差的缺点,限制了其发展。因此,我们将可德兰多糖(curdlan)和OHTCC通过化学连接制备可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物(C-O),并制成纳米粒,研究其理化性质和体外活性,并将其作为H1N1流感病毒重组亚单位疫苗佐剂进行研究,考察其对H1N1诱导的免疫应答的作用。本文主要研究内容包括:(1)采用EDC/NHS为催化剂,通过优化反应条件化学连接将可德兰多糖与OHTCC连接制备得到C-O;通过红外光谱光谱、核磁共振1H谱、元素分析对其结构进行表征。(2)采取超声法制备C-O纳米粒,并用电位粒径仪对粒径、电位检测,并用BCA法测定其抗原荷载率以及体外释放。(3)对C-O纳米粒的体外免疫活性进行评价,检测其对腹腔提取的巨噬细胞的增殖、吞噬作用以及NO、IL-6、IL-1β等炎症因子分泌的影响;检测对树突状细胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86以及MHC Ⅱ、MHC Ⅰ的表达影响;检测其对脾淋巴细胞的增殖作用。(4)对C-O纳米粒作为流感病毒亚单位鼻黏膜疫苗佐剂的体内免疫活性进行评价,分两次滴鼻免疫小鼠,对免疫后小鼠的血清以及黏膜表面所产生的H1N1特异性抗体浓度进行检测,并检测相关细胞的表面标记。研究结果与结论:(1)制得的C-O为白色絮状固体,产率为75.1%,其含有的琥珀酰化可德兰多糖和OHTCC的比例为1:6.14。制备工艺相对简单,安全低毒。(2)C-O能制成了形态均一的球型纳米粒,粒径为190.53 nm,Zeta电位为15.93 mV,在4℃下能稳定保存6 w左右。其抗原吸附率为60.02%,并且能够在中性条件下能缓慢释放,延长抗原作用时间,具有成为蛋白等负电荷物质载体的可能性。(3)在体外实验中,C-O纳米粒能够促进APCs的活化,刺激脾淋巴细胞的增殖。能够促进巨噬细胞对外来抗原的吞噬作用,提高NO、IL-1β、IL-6等因子的分泌,同时能够促进下游COX-2蛋白的表达;能够使DCs表面的MHC II以及共刺激分子CD40、CD80、CD86上调,促使DCs活化和成熟,提高IL-12的分泌,并且能上调MHC Ⅰ的表达,从而引起交叉递呈;并且能直接刺激脾淋巴细胞大量增殖。证明C-O纳米粒能够促进APCs的活化,刺激脾淋巴细胞的增殖。(4)在体内试验中,将C-O纳米粒作为佐剂H1N1流感疫苗鼻黏膜佐剂,能提高重组H1N1血凝素(hemagglutinin,HA)的免疫原性,促进APCs的募集和活化,使淋巴细胞增殖、活化,并且诱导机体产生H1N1特异性抗体,并且能够引起口腔和阴道黏膜分泌sIgA抗体,引起局部黏膜免疫。C-O纳米粒性质稳定,具有载体性质,在体内外实验研究中表现出了良好免疫活性,并能诱导黏膜免疫应答。这些性质都表明C-O纳米粒具有成为鼻黏膜佐剂的潜能,为流感疫苗的研制提供了新的思路。