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猪传染性胸膜肺炎（Porcine pleuropneumoniae）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus Pleuropneumoniae,APP）引起的以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的接触性传染病。本病在世界各地广泛流行，常常造成巨大的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌的14个血清型产生4种不同的APX毒素，即APXⅠ、APXⅡ、APXⅢ及APXⅣ。其中APXⅡ存在于除血清型10以外的所有血清型中，其操纵子仅包含激活基因APXⅡC和结构蛋白基因APXⅡA，但没有分泌蛋白B和D基因。该毒素是胸膜肺炎放线杆菌的主要抗原之一，在本病的诊断和疫苗研制中占有重要地位。 本试验旨在利用APXⅡ为APP的主要抗原这一特点，在原核系统中对其结构蛋白基因APXⅡA进行表达，将表达产物进行初步纯化，为建立猪传染性胸膜肺炎的ELISA诊断方法和基因工程疫苗的研制提供技术支撑。从国内流行的主要血清型7型APP中提取菌体DNA，PCR方法扩增出APXⅡA基因，扩增产物连接到pMD-18-T载体中，转化JM109菌后进行筛选，得到的重组质粒经酶切、PCR鉴定并经测序证明所测结构蛋白APXⅡA核苷酸序列与国外GeneBank中的参考序列同源性为99.8％。随后以重组质粒为模板用特异性表达引物扩增得到目的基因APXⅡA，对目的基因和表达载体pGEX-4T-1分别以相同的限制性内切酶酶切后，经连接酶连接构建成重组表达载体，转化宿主菌BL21（DE3）PLYSs后得到重组质粒pGEX-APXⅡA，通过酶切及PCR扩增鉴定筛选出阳性克隆，测序证明目的基因正确插入到表达载体。随后用IPTG诱导APXⅡA基因的表达，收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting分析检测。结果表明结构蛋白APXⅡA基因在大肠埃希氏菌中能高效表达，表达量占菌体蛋白总量的24.5％，表达的目的蛋白分子量约为102.5Kda，该表达产物为融合蛋白，能被传染性胸膜肺炎阳性血清所识别。进一步的试验证明表达产物为不溶性的包涵体蛋白，此包涵体蛋白不易降解，经溶解、变性、复性等一系列的纯化处理可得到初步纯化的APXⅡA蛋白。本试验为以后更进一步研究APXⅡA的结构和功能，建立传染性胸膜肺炎的诊断方法奠定了基础，同时为新型疫苗的研制提供了技术支持。