桃(Prunus persica(L. ) Batsch)果实属于跃变型果实,采收后极易软化,给贮藏运输带来极大不便。传统的桃果实贮运保鲜不仅费用高且保鲜期有限,无法解决桃采后软化腐烂问题。通过常规育种的方法虽然有望解决,但由于桃为多年生果树,选育时间较长和种植资源的限制,很难在短时间内有所突破。桃果实成熟后的软化与多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)大量降解果胶有关。通过反义基因技术特异性抑制果实成熟后PG的表达,有望延迟桃果实的软化,获得耐储性硬溶质桃新种质。这一技术在番茄上已取得成功,为利用反义PG基因技术解决桃果实的成熟软化难题提供了重要的理论依据。本研究运用基因克隆技术获得桃PG基因全序列,并构建其反义序列植物表达载体,为下一步进行外植体的遗传转化奠定了实验基础。本研究取得如下试验结果:(1)用Trizol法和改良Trizol法提取白粉桃总RNA,其中改良Trizol法提取的桃果肉RNA效果较好。根据已发表的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的序列设计合成一对特异引物,经过RT-PCR,扩增出一条1188bp的目的片段,包括一个393个氨基酸组成的开放阅读框架。通过TA克隆,把它连接到pGEM-T vector上。PCR、酶切鉴定后进行基因测序,结果表明所克隆的PG基因与GenBank中登录的肥城桃PG基因序列(AF095577)同源性为98.65%,相应的氨基酸的同源性为97.46%,克隆载体命名为pGEM-PG。表明已获得PG基因。(2)用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切pGEM-PG和pBI121两种质粒DNA,分别回收PG基因片段和除去了gus基因的pBI121线状载体,将pBI121线状载体与PG基因反向连接,转化大肠杆菌感受态细胞,获得重组质粒。对重组质粒经PCR鉴定、BamH I和Sac I双酶切鉴定,均获得1.2kb的目的片段。证明目的基因片段已反向插入。以上结果表明,成功构建了PG基因反义植物表达载体pBI-aPG,为下一阶段进行遗传转化奠定了必要的研究基础。(3)采用直接转化法将反义植物表达载体pBI-aPG导入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中,通过PCR方法鉴定转化成功。