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动脉粥样硬化是一种血管壁的慢性疾病，主要症状为大中动脉内膜下脂质沉积，内膜增厚，形成粥样斑块。动脉粥样硬化是中风、心肌梗死、缺血性心力衰竭和其他心脏病的主要原因，在西方国家，50％的死亡根本原因为动脉粥样硬化。在动脉粥样硬化发病过程中，血管平滑肌细胞的作用至关重要，它的异常增殖、迁移和分化导致了血管的病理学变化。内膜增厚也是动脉粥样硬化发展中的一项典型病理特征。miRNA在基因转录后水平的调节中发挥重要作用，它能够与靶基因mRNA的3UTR区碱基互补，引导沉默复合物降解靶标分子或者抑制mRNA的翻译。在过去十年的研究中表明，miRNA在各种心血管疾病的发病过程中发挥调控作用。也有一些研究表明，动脉粥样硬化的发生与miRNA的异常表达高度相关。曾经有报道miR-17-5p可以用来作为诊断冠状动脉粥样硬化的分子标记，具有很高的特异性和灵敏度。但是miR-17-5p在动脉粥样硬化发展中的具体作用和机制还不清楚，因此，本研究通过临床样本检测、动物和细胞实验，初步探讨miR-17-5p在动脉粥样硬化发展中的作用和机制。 极低密度脂蛋白受体(VLDLR)属于LDLR超家族的成员之一，是主要在心脏、肌肉、脂肪细胞和脑中表达的外周脂蛋白受体。它能够与含有载脂蛋白E的脂蛋白结合，如极低密度脂蛋白、乳糜微粒、中间密度脂蛋白等。在LDLR缺陷型小鼠中用腺病毒介导的肝脏中VLDLR过表达，显示出VLDLR在预防动脉粥样硬化病变形成以及脂肪条纹病变的潜力。目前认为，VLDLR也是动脉粥样硬化表达中重要的调控因子。本研究发现，VLDLR可能是miR-17-5p的潜在靶分子，基于此预测，本研究提出了一条基于新的miRNA调控通路的科学假设并进行实验研究，具有十分重要的理论和应用价值，有利于探索新的药物靶点，将会为动脉粥样硬化的诊断和治疗提供新的方向。以下为本研究各部分内容的概述: 第一部分动脉粥样硬化患者中miR-17-5p与VLDLR的表达相关性 目的:明确动脉粥样硬化发病与miR-17-5p、VLDLR的相关性。 方法:以30对来源于动脉粥样患者和健康人群的外周血样本为研究材料，通过Real-time PCR检测各样本中miR-17-5p和VLDLR mRNA表达量，对比miR-17-5p及VLDLR在动脉粥样硬化组和健康对照组之间的表达差异。 结果:Real-time PCR检测miR-17-5p表达结果显示，动脉粥样硬化患者外周血中的miR-17-5p的表达量显著高于对照组(P＜0.01)。Real-time PCR检测VLDLR的结果显示，VLDLR mRNA表达水平显著低于对照组（P＜0.01）。 结论:(1)动脉粥样硬化发病与外周血中miR-17-5p的表达水平呈正相关。(2)动脉粥样硬化发病与外周血中VLDLR的表达水平呈负相关。 第二部分动脉粥样硬化小鼠中miR-17-5p对动脉粥样硬化的影响 目的:探讨miR-17-5p对动脉粥样硬化小鼠的影响，初步阐述其作用机制;评估miR-17-5p作为治疗动脉粥样硬化靶位点的应用价值。 方法:用高脂饲养ApoE-/-小鼠12周构建动脉粥样硬化小鼠模型，注射antagomiR-17-5p及NC miRNA干扰小鼠体内的miR-17-5p的表达。通过HE染色检测各组小鼠动脉血管的病理变化，测量各组小鼠血管内膜、中膜面积，计算内膜/中膜面积比(I/M)，测量管腔面积，探讨干扰miR-17-5p对动脉粥样硬化的治疗作用。通过免疫荧光、Real-time PCR、Western blot检测各组小鼠动脉组织中VLDLR的表达，Real-time PCR、Western blot检测PCSK9的表达，Western blot检测Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP蛋白的表达， ELISA检测血管炎症因子(TNF-α、IL-6，IL-10)水平，试剂盒法检测MDA、SOD及髓过氧化物酶(MPO)水平及活性，进一步探讨miR-17-5p作用的分子机制。 结果:HE染色结果显示AS小鼠与对照组相比，其血管内皮形成了明显的斑块，平滑肌细胞排列紊乱，内膜增生，而antagomiR-17-5p处理的小鼠与NC miRNA组相比，病变程度明显减轻。动脉粥样硬化小鼠比对照小鼠的内膜面积明显增加，抑制miR-17-5p的作用之后，内膜面积减少;各组小鼠中中膜面积差异不显著。计算I/M值，antagomiR-17-5p组小鼠比NC-miRNA组显著减小(P＜0.05)。AS模型组和NC-miRNA组小鼠的血管管腔面积比对照组明显减小，而antagomiR-17-5p组则缓解了这种作用，结果差异具有显著性(P＜0.05)。免疫荧光、Real-time PCR、Western blot检测各组小鼠动脉组织中VLDLR的表达，结果显示动脉粥样硬化小鼠中VLDLR的表达量显著下降，抑制miR-17-5p的作用使得VLDLR水平上升。通过Real-time PCR和Western blot检测PCSK9在mRNA和蛋白水平上的表达变化，结果与VLDLR相反，在AS模型组中PCSK9在mRNA和蛋白水平上的表达量均显著上调，在antagomiR-17-5p组中表达量显著下调。Western blot检测结果显示，动脉粥样硬化小鼠中Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达水平上调，Bcl-2水平降低，抑制miR-17-5p的作用使Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达水平降低，Bcl-2水平上调;ELISA检测结果显示，AS模型小鼠TNF-α、IL-6水平升高，IL-10水平降低，抑制miR-17-5p的作用后则TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平上调;细胞氧化应激指标检测结果表明，AS模型小鼠MDA、MPO水平上调，SOD活性降低，抑制miR-17-5p的作用能够抑制MDA、MPO水平及活性，上调SOD酶活性。 结论:(1)抑制miR-17-5p对小鼠中的动脉硬化具有显著的治疗作用，能够有效缓解动脉粥样硬化小鼠动脉血管的病理变化，减少斑块的形成，缓解AS造成的内膜增生和管腔狭窄。(2)干扰miR-17-5p的表达量上调动脉组织中VLDLR的表达量。(3)干扰miR-17-5p的表达量下调动脉组织中PCSK9的表达。(4)干扰miR-17-5p的表达量抑制动脉组织中细胞凋亡。(5)干扰miR-17-5p的表达量抑制动脉组织中炎症反应与氧化应激。 第三部分 miR-17-5p直接调控平滑肌细胞中VLDLR的表达 目的:探讨miR-17-5p在血管平滑肌细胞中靶向VLDLR调控其表达的机制; 方法:利用TargetScan对miR-17-5p和VLDLR之间的靶向调控关系进行了预测;体外培养人的血管平滑肌细胞，通过双荧光素酶实验验证miR-17-5p对VLDLR的直接调控作用。在血管平滑肌细胞中转染miR-17-5p inhibitor及其对照，然后通过Real-time PCR和Western blot检测VLDLR的表达量。构建PCSK9重组质粒，转染血管平滑肌细胞，然后通过Real-time PCR和Western blot检测VLDLR的表达量变化。 结果:TargetScan在线网站对miR-17-5p与VLDLR之间相互作用的预测结果显示VLDLR可能是miR-17-5p的潜在靶位点。在血管平滑肌细胞中进行的双荧光素酶实验结果显示VLDLR3UTR与miR-17-5p共转染导致荧光素酶活性显著下降，表明miR-17-5p能够直接结合VLDLR3UTR区，抑制VLDLR的表达。对VLDLR的Real-time PCR和Western blot的检测结果显示转染miR-17-5p inhibitor之后，VLDLR的表达量明显上升(P＜0.01)。Real-time PCR和Western blot的检测结果显示转染PCSK9之后，VLDLR的表达量明显降低(P＜0.01) 结论:(1) miR-17-5p直接靶向VLDLR mRNA的3UTR区，下调VLDLR的表达。(2)抑制血管平滑肌细胞中miR-17-5p的表达，可以提高VLDLR的表达量。(3) PCSK9能够负调控VLDLR的表达。