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目的:1.构建IQGAP1基因过表达和基因干扰的稳转细胞系及其对照细胞系。2.通过体内外实验分别检测IQGAP1基因对血管生成的影响。3.研究IQGAP1对血管生成影响的分子机制。方法:1.利用Lipofectamine 2000将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的IQGAP1过表达质粒和它所对应的对照质粒分别转染到人食管癌细胞EC9706,用G418耐药单克隆细胞的筛选方法,等到稳定生长后,荧光显微镜下观察其细胞定位,并通过Western blot检测GFP-IQGAP1融合蛋白的表达,确定IQGAP1过表达的稳转细胞系是否构建成功。2.利用Lipofectamine 2000将IQGAP1干扰质粒及其对照质粒转染进人食管癌细胞KYSE150内,采用G418筛选耐药克隆,待其稳定生长后,荧光显微镜下观察KYSE150细胞GFP的表达,并通过Western blot检测对照组与干扰组IQGAP1蛋白的表达情况,确定IQGAP1干扰的稳转细胞系是否构建成功。3.分别通过体外HUVECs小管形成实验和体内的鸡胚尿囊膜实验来检测IQGAP1基因表达对肿瘤血管生成的影响。4.采用Western blot技术研究IQGAP1对食管癌细胞中VEGFA与其受体VEGFR2、p-VEGFR2血管生成相关因子表达的影响。5.通过Western blot技术研究IQGAP1对Akt和ERK活化的影响。6.在IQGAP1过表达组细胞中加入Akt和ERK抑制剂进行干预处理后,观察抑制剂对VEGFA和p-VEGFR2蛋白表达的影响及对血管生成的影响。结果:1.荧光显微镜下观察发现,在转染含GFP-IQGAP1重组质粒的EC9706细胞中观察到其为胞质定位;Western blot结果显示,在IQGAP1过表达细胞中有GFP-IQGAP1融合蛋白的表达,而在其对照组内则没有,说明IQGAP1过表达的稳转细胞系已构建成功。2.在荧光显微镜下可观察到,GFP在转染IQGAP1干扰质粒及对照质粒的KYSE150细胞中为全细胞定位;对支架蛋白IQGAP1在干扰组细胞内的表达量与其在对照组细胞内的表达量通过Western blot进行比较,发现其表达量显著降低,有统计学意义(P<0.0001)。3.体外HUVECs小管形成的实验结果显示,与对照组相比较,IQGAP1过表达组小管生成数更多,而且所生成小管的管腔结构更加完整,两者差异有统计学意义(P<0.0001),表明IQGAP1过表达在体外可以促进血管的生成;体内鸡胚尿囊膜的实验结果也显示,IQGAP1过表达组生成的血管数量较对照组多,并且所生成血管的形态舒展,颜色较为鲜红,经统计学分析,差异有统计学意义(P<0.001),说明IQGAP1过表达可以促进体内血管的生成;体内外实验结果一致,表明IQGAP1过表达后会促进肿瘤血管的生成。4.IQGAP1干扰组采用体外HUVECs小管生成实验,结果显示,与对照组相比较,发现IQGAP1基因干扰后小管生成数较少,生成小管的管腔结构也不完整,差异有统计学意义(P<0.0001),表明IQGAP1干扰后在体外可以抑制血管的生成;体内鸡胚尿囊膜实验结果显示,IQGAP1基因干扰后所生成的血管数量较对照组少,生成的血管色泽灰暗并且主血管较少,经数据统计得,两者之间的差异有统计学意义(P<0.001);上述体内外实验结果一致,表明干扰IQGAP1基因表达后能够明显抑制肿瘤的血管生成。5.在IQGAP1过表达的细胞中,经Western blot检测发现,VEGFA与p-VEGFR2蛋白表达量与其在对照细胞内的表达量相比都升高,差异有统计学意义(P<0.0001),而VEGFR2蛋白的表达量则在IQGAP1过表达组与其对照组细胞中无明显差异,表明IQGAP1可能通过VEGFA与VEGFR2相互作用后促进VEGFR2发生磷酸化,进而促进血管的生成。6.在IQGAP1干扰组细胞中,经Western blot检测发现,VEGFA与p-VEGFR2蛋白的表达量与其在对照细胞内相比,表达量都降低,差异有统计学方面的意义(P<0.0001),而VEGFR2的表达量则在IQGAP1干扰组与其对照组中无明显差异,表明IQGAP1可能通过阻断了VEGFA与其受体VEGFR2的相互作用进而抑制血管生成的过程。7.经Western blot检测发现,IQGAP1过表达组细胞中p-Akt、p-ERK蛋白的表达量与其在对照组的结果比较,发现两者的表达量都升高,差异有统计学的意义(P<0.0001);而IQGAP1干扰组细胞p-Akt、p-ERK的表达量均低于其在对照组内的表达量,差异有统计学意义(P<0.0001);说明IQGAP1对肿瘤细胞血管生成的发生机制的调控可能通过活化Akt和ERK信号通路发挥作用的。8.在IQGAP1过表达组细胞中加入Akt和ERK抑制剂干预后,VEGFA和p-VEGFR2蛋白的表达量显著降低,并且经抑制剂干预后血管生成数也降低,说明IQGAP1可能通过AKT或ERK/VEGFA-VEGFR2信号通路来影响肿瘤血管生成。结论:1.成功构建了IQGAP1过表达稳转细胞系及IQGAP1干扰的稳转细胞系。2.IQGAP1过表达可以促进体内外肿瘤的血管生成,而干扰IQGAP1表达后则会有效的抑制肿瘤血管的生成。3.IQGAP1对食管癌中血管生成的作用机制可能与VEGFA与VEGFR2相互作用后活化VEGFR2有关,以及与Akt和ERK信号通路活化有关。4.IQGAP1过表达组细胞中加入Akt和ERK抑制剂干预后,可能阻断了Akt或ERK/VEGFA-VEGFR2信号通路,进而导致血管生成作用被有效抑制。