论文部分内容阅读
目的:1,建立快速眼动(Rapid eye movement,REM)睡眠剥夺模型。2,探究REM睡眠剥对大鼠外周脾脏辅助性T细胞17(Thl7,CD4~+ILl7+)、调节性T细胞(Treg,CD4~+CD25+Foxp3+)及Th17/Treg细胞平衡的影响。3,观察睡眠剥夺后大鼠中枢神经细胞组织形态学变化及IL-17炎性蛋白和Th17细胞的浸润。4,探究睡眠剥夺后大鼠中枢脑组织中IL-17、TGF-β、IL-6、RORγt、Foxp3等相关细胞因子mRNA转录水平的变化。通过探讨睡眠剥夺后机体外周及中枢神经系统免疫炎症反应的变化,进一步探究睡眠剥夺后机体及脑的免疫损伤及机制。方法:SD雄性大鼠随机分为正常对照组(cage control,CC)、REM睡眠剥夺组(REM sleep deprivation,SD),SD组又分为睡眠剥夺1天(SD1)、3天(SD3)和5天(SD5)组。每组12只大鼠。1,应用改良多平台水环境法(modified multiple platform method,MMPM)建立REM睡眠剥夺模型,观察大鼠的一般行为学改变及体重变化。2,称量大鼠的脾脏重量,提取脾脏单个核细胞,通过流式细胞术检测REM睡眠剥夺大鼠外周脾脏淋巴细胞中Th17、Treg细胞的比例及Th17/Treg细胞平衡的变化,计算并分析各组Th17、Treg细胞的比例及Th17/Treg细胞的比值。3,通过HE染色和尼氏染色观察大鼠中枢脑组织中细胞的形态学变化。4,通过组织免疫荧光染色检测CC组和REM睡眠剥夺组大鼠脑组织中IL-17炎性蛋白和Th17细胞的浸润。通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测睡眠剥夺后大鼠中枢脑组织中IL-17、TGF-β、IL-6、RORγt、Foxp3等细胞因子mRNA转录水平的变化。结果:1,大鼠在水平台上入睡时因低头触水反复觉醒,从而建立睡眠剥夺模型。睡眠剥夺使大鼠出现烦躁、易激惹、攻击性增强等精神行为改变,体重明显减轻,脾脏重量增加。2,流式细胞分析显示大鼠脾脏淋巴细胞中Th17细胞占淋巴细胞的比例SD3组、SD5组较CC组、SD1组显著升高(P<0.05),CD4~+细胞占淋巴细胞的比例SD5组较CC组(P=0.023)、SD1组(P=0.017)显著升高;Th17细胞占CD4~+细胞的比例SD3组(P=0.005)、SD5组(P=0.032)较CC组显著升高,Treg细胞占CD4~+细胞的比例SD3组、SD5组较CC组、SD1组显著升高(P<0.05),SD5组较SD3组也显著升高(P=0.046);Th17/Treg的比值SD1组、SD3组较CC组增加,其中SD1组的差异具有显著性(P=0.022),而SD5组较CC组、SD1组降低,与SD1组差异有显著性(P=0.002)。3,HE染色和尼氏染色显示睡眠剥夺后大鼠下丘脑和海马的神经细胞发生轻度变化,可见胞体变小、尼氏体减少、细胞核浓染,细胞周围间隙较正常组增大,白质内可见神经纤维疏松和离散,可见个别细胞与周围组织界线模糊;免疫荧光染色显示睡眠剥夺3天组大鼠下丘脑IL-17阳性细胞及IL-17的表达量增多,可见Th17细胞浸润明显增加。4,RT-qPCR显示睡眠剥夺后大鼠脑组织中IL-17、IL-6、TNF-α、IL-1等促炎性细胞因子及Th17特异性转录因子RORγt的mRNA表达水平升高差异有显著性(P<0.05),IL-23及抗炎性细胞因子TGF-β的mRNA表达水平未见显著差异,而Treg细胞的特异性转录因子Foxp3的转录水平在睡眠剥夺3天内降低,第5天时显著升高(P<0.001)。结论:1,成功建立了REM睡眠剥夺模型。睡眠剥夺后大鼠精神行为发生明显改变,体重减轻、能量代谢失衡,脾脏重量增加,机体呈免疫激活状态。2,睡眠剥夺使大鼠脾脏淋巴细胞中Th17及CD4~+细胞的比例增加,CD4~+细胞中Th17细胞的比例随睡眠剥夺时间的延长逐渐升高,而Treg细胞的比例先降低后逐渐升高,故睡眠剥夺使Th17/Treg比值先升高,后逐渐降低,外周脾脏Th17/Treg细胞平衡被打破。3,睡眠剥夺使大鼠下丘脑、海马的神经细胞发生轻度形态学改变,神经细胞受到损伤;其可能机制是睡眠剥夺通过促进中枢促炎性细胞因子IL-17及炎性细胞Th17的浸润介导神经细胞的损伤。4,睡眠剥夺有可能通过增加大鼠脑中IL-17、IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子、抑制TGF-β抗炎因子的基因表达来促进中枢的炎性损伤;同时睡眠剥夺也可能通过上调Th17的特异性转录因子RORγt、抑制Treg细胞的特异性转录因子Foxp3的基因表达,促进中枢Th17炎性细胞的浸润和IL-17炎性因子的表达,该过程也可能是通过减少TGF-β诱导产生Foxp3、增加IL-6与TGF-β诱导产生RORγt来调节炎性反应的方向。