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目的：观察养血解毒方及其重要成分落新妇苷对咪喹莫特(Imiquimod, IMQ)诱导的银屑病样野生型和Stat3过表达转基因小鼠的干预作用,同时观察落新妇苷对体外Th17和γδT细胞分化、细胞因子表达、分化相关转录因子表达的影响,明确落新妇苷抑制炎症反应的作用靶点。深入探讨养血解毒方干预炎症反应的作用机制,为临床治疗银屑病提供潜在药物的基础研究。方法：Balb/c雄性小鼠,随机分为正常对照(Ctrl)组(灌服生理盐水及外涂凡士林,1次/天×7天)、模型(IMQ)组(灌服生理盐水及外涂4%IMQ乳膏42mg制备银屑病样皮损,1次/天×7天)、养血解毒(YXJD)组,凉血解毒(LXJD)组,活血解毒(HXJD)组(折算为小鼠剂量的中药复方水煎剂灌胃及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天×7天),落新妇苷高剂量组(Astilbin-Higb, AH) (10mg/Kg浓度的落新妇苷溶液灌胃及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天×7天),落新妇苷低剂量组(Astilbin-Low, AL) (5mg/Kg浓度的落新妇苷溶液灌胃及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天x7天),阳性对照(雷公藤多苷GTW/甲氨蝶呤MTX)组(10mg/Kg雷公藤多苷溶液,1mg/Kg甲氨蝶呤溶液灌胃及外涂咪喹莫特乳膏同IMQ组,1次/天×7天)。C57BL/6J小鼠、Stat3过表达雄性小鼠,随机分为野生型正常对照组(Wild Type-Ctrl, WT-Ctrl),野生型模型组(WT-IMQ),野生型养血解毒高剂量组(WT-Yang Xue Jie Du decoction-High, WT-YH),野生型养血解毒低剂量组(WT-Yang Xue Jie Du decoction-Low, WT-YL),野生型甲氨蝶呤组(WT-MTX), Stat3过表达正常对照组(Stat3-Ctrl), Stat3过表达模型组(Stat3-IMQ), Stat3过表达养血解毒高剂量组(Stat3-YH),Stat3过表达养血解毒低剂量组(Stat3-YL), Stat3过表达甲氨蝶呤组(Stat3-MTX)。运用银屑病皮损面积和疾病严重程度(Psoriasis Area and Severity Index, PASI)评分标准观察银屑病样小鼠模型皮损变化情况,于给药第8天取材,光镜下观察皮损组织形态学变化、测量表皮层厚度；免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)反映表皮角质形成细胞增殖程度；检测皮损中CD3,反映皮损T淋巴细胞浸润程度,免疫荧光法检测involucrin反映表皮分化情况；检测脾脏、腹股沟浅表淋巴结重量,流式细胞术检测脾脏和腹股沟浅表淋巴结中CD3+、CD4+、CD8+细胞比例,流式细胞术检测各组小鼠淋巴结、脾脏和骨髓中CD3+γδTCR+细胞比例；CBA法检测小鼠血清中炎症相关因子含量；RT-PCR和Western Blot方法检测皮损中IL-17相关细胞因子和Stat3信号通路相关蛋白的表达。分选小鼠脾细胞中幼稚T细胞,在anti-CD3及anti-CD28包被的培养板中加入含TGF-beta1、IL-6、IL-1β、anti-IL-2、 anti-IL-4、anti-IFN-gama及IL-23的10%FBS完全1640培养基诱导Th17细胞分化,落新妇苷以100μg/ml,10μg/ml,1μg/ml, 0.1μg/ml,0.01μg/ml终浓度培养3天。cck-8法检测落新妇苷对细胞活性的影响；流式细胞仪检测落新妇苷对Th17细胞分化的影响及Th17细胞分泌IL-17A的含量测定；RT-PCR检测细胞因子RORγtmRNA表达。分选脾细胞中γδT细胞,加入含I1-23和IL-1β10%FBS完全1640培养基,落新妇苷以10μg/ml,5μg/ml,2.5μg/ml终浓度培养24h, RT-PCR检测细胞因子IL-17A、IFN-γmRNA表达。结果：1.IMQ组小鼠皮肤出现红斑,鳞屑、皮肤增厚等类似银屑病样皮损。与IMQ组比较,YXJD组和LXJD组小鼠银屑病样皮损症状缓解,PASI分数降低,表皮层厚度较IMQ小鼠显著降低(P<0.001),表皮角化不全减轻,角质形成增殖减少,T淋巴细胞浸润减弱,HXJD组小鼠银屑病改变缓解效果较弱,作用不及前两组。2.Stat3过表达转基因小鼠较野生型小鼠外观无显著差异,皮肤表皮层略厚,真皮显著增厚,皮肤中IL-17A、lL-22、RORγt、IL-17C mRNA分别较野生型小鼠高约2倍、16倍、2倍和3倍。对比两组模型小鼠可发现Stat3-IMQ小鼠较WT-IMQ小鼠皮损红斑颜色更深,鳞屑成片状且易脱落,皮肤肥厚浸润更加显著,表皮层厚度、增殖的细胞数、真皮中CD3+细胞显著多于WT-IMQ小鼠,Stat3-IMQ小鼠脾脏增大较WT-IMQ脾脏高2倍,皮损中IL-17A、IL-22、RORyt、IL-17C mRNA分别较WT-IMQ小鼠高达24倍、8倍、2.5、2倍。IMQ诱导两种小鼠无论在外观银屑病样皮损,还是表皮层增殖、真皮T淋巴细胞浸润、皮损和外周血中炎症相关因子的表达情况和分泌含量都与Ctrl组具有明显的统计学差异。Stat3-Y组小鼠较Stat3-IMQ小鼠皮损症状显著缓解,PASI分数降低,角质形成增殖减少,真皮T淋巴细胞浸润减弱,皮肤中水分和油分含量高于Stat3-IMQ组(P<0.05)。同时,Stat3-Y组小鼠脾脏重量、皮损中IL-17A、Il-22、RORγt、IL-17C mRNA表达和外周血中炎症相关的细胞因子(IL-17A、IL-6、TGF-α、IL-2、IL-4、IFN-γ)显著低于Stat3-IMQ小鼠(P<0.05)。分析小鼠皮损Stat3通路蛋白的表达可以发现：Stat3-Ctrl组Stat3、P-Stat3、Jak3、P-Jak3蛋白的表达量对高于WT-Ctrl组;Stat3-IMQ组P-Stat3、P-Jak3蛋白的表达量对高于WT-IMQ组；与Ctrl组比较,IMQ组Stat3、 P-Stat3、Jak3、P-Jak3蛋白的表达量升高;Stat3-Y组与WT-Y组表达的P-Stat3、 P-Jak3蛋白都比对应的IMQ组低。3.AH组和AL组小鼠皮肤红斑的出现、色泽及浸润范围、鳞屑的大小、鳞屑厚度、皮肤增厚都要小于同期的IMQ组改变。组织学检测显示AH和AL组小鼠皮肤表皮层平整,角化不全的细胞明显减少,表皮层厚度、增殖的细胞数、皮损中CD3+细胞数量明显低于IMQ组(P<0.01)。同时落新妇苷显著抑制了淋巴结和脾脏的增生,流式细胞术结果显示落新妇苷可抑制淋巴结中CD4+比例,并调节淋巴结中CD4+与CD8+细胞比例。AH组小鼠脾脏、淋巴结和骨髓中CD3+y8TCR+细胞比例较IMQ组小鼠显著降低。AH组小鼠皮肤中IL-17AmRNA、IL-22mRNA、 IL-17CmRNA、RORγtmRNA、CCR6mRNA、CCL20mRNA相对表达水平均低于IMQ组小鼠(P<0.05)。AH组血清中IL-17A、IL-6、TGF-α、IL-2、IL-4、IFN-γ含量均低于IMQ组(P<0.05)。皮损蛋白检测发现落新妇苷组p-Stat3、p-Jak3蛋白表达显著低于IMQ组。4.与Th17 polarizing组相比,落新妇苷各浓度(10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、 0.01μg/ml)对Th17 (CD4+IL-17+)分化比例有显著影响,各组Th17比例分别为12.14±1.47%、13.24+2.16%、14.42+4.09%、15.13±3.52%&22.45±1.92%。流式细胞仪检测各组细胞中IL-17-PE的荧光强度,与Neutral相比,Th17 polarizing培养可显著提高IL-17-PE的荧光强度,落新妇苷组IL-17-PE的荧光强度显著降低。与Neutral condition组相比,Th 17 polarizing condition组IL-17A含量和RORyt mRNA表达水平显著升高。落新妇苷各剂量组均可抑制IL-17A分泌和RORytmRNA的表达。5.体外诱导γδT中CD3+γδTCR+细胞比例、CCR6+γδTCR+细胞较未诱导组增多,与诱导组相比,落新妇苷10μg/ml组中CD3+γδTCR+细胞和CCR6+γδTCR+细胞比例低于诱导组。落新妇苷各剂量组γδT细胞中IL-17AmRNA的表达显著低于诱导组。结论：1.养血解毒方和凉血解毒方可显著改善IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损,抑制表皮细胞增生、异常分化、炎症细胞浸润等银屑病样病理表现；活血解毒方也可一定程度上改善银屑病样表现,但在改善表皮角质形成细胞增殖和真皮T淋巴细胞浸润方面比养血解毒方和凉血解毒方作用较差。2.咪喹莫特诱导的Stat3过表达转基因小鼠模型在组织病理改变、细胞水平和分子水平更接近人类银屑病的改变,可作为模拟银屑病更为贴切的动物模型,用于药物筛选和机制探索等研究。养血解毒方可显著缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损,改善表皮屏障功能,调节模型免疫紊乱,减少皮损和外周血中IL-17相关炎症细胞因子的表达,调节Stat3通路蛋白磷酸化的活性表达。养血解毒方通过抑制Stat3信号通路的过度活化,进而抑制表皮细胞增生、调节机体内IL-17相关免疫应答反应。3.落新妇苷可抑制咪喹莫特诱导的银屑病样炎症爆发的强度及银屑病样皮损的形成。降低Stat3通路蛋白活性,抑制Th17细胞分化转录因子RORγt mRNA的表达及IL-17相关细胞因子蛋白和mRNA表达水平。落新妇苷对体外Th17和γST细胞分泌细胞因子的表达有抑制作用,可能是通过抑制细胞转录因子RORγt的表达抑制IL-17A的产生,调控IL-17介导的自身免疫反应,这可能是落新妇苷缓解小鼠银屑病样皮损改变的机制之一,落新妇苷作为潜在的治疗银屑病的药物值得关注。