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枣(Zizyphus jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属落叶乔木,其广泛分布在亚洲和美洲的热带、亚热带地区。我国是世界上枣的主要生产国和唯一出口国,90%以上的枣产于我国。枣不仅是滋补佳品,而且也是一味传统的中药,因富含营养和保健成分而享誉中外,为我国传统药食兼用果品。然而,我国枣资源开发利用程度较低,缺乏对其进行相应的精深加工技术及其功能性的系统研究。目前,多糖由于其具有促进多种免疫缺损疾病、抗肿瘤、抗补体、降低血糖血脂等功能而备受关注。本论文通过研究分析五种常用枣的基本营养成分,确定了以金丝小枣(ZiZyphus Jujuba cv.Jinsixiaozao.)为试验原料,系统研究了金丝小枣多糖的提取、分离纯化、结构特征和免疫活性,并对五种枣的抗氧化性进行了深入分析。
通过分析五种枣(金丝小枣、骏枣、牙枣、尖枣、三变红枣)的总糖、还原糖、粗纤维、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等成分,并对它们进行分析比较,确定了金丝小枣作为提取枣多糖的较佳原料。
运用响应面分析方法,探讨了超声波提取金丝小枣多糖的优化工艺。通过考察超声功率、超声时间、提取温度、料液比对金丝小枣多糖得率与纯度的影响,得出金丝小枣多糖最佳的提取工艺条件为:超声功率86W-96W,提取温度45℃-53℃,提取时间20min,料液比1:20。与传统的水浴浸提法相比,该方法不仅缩短了提取时间,且金丝小枣多糖的得率从6.52%增加到8.11%,纯度增加了1.2倍。超声波提取法和传统水浴浸提法所得粗多糖的单糖主要有阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal),两种方法提取粗多糖的组成基本是一致的。用红外光谱分析超声波与水浴浸提这两种方法所得枣多糖,可知两种方法所得的枣多糖的峰形位置基本相同;且超声波提取法与传统浸提法所得的枣多糖免疫功效基本相同。
与其它脱色剂相比,聚酰胺脱色效果较好,金丝小枣粗多糖(ZSP)的回收率较高,同时可去除粗多糖中的蛋白质和杂质,故本试验确定聚酰胺为理想的脱色剂。其脱色的最佳工艺条件为:聚酰胺用量为需脱色金丝小枣粗多糖的4倍,聚酰胺柱用1倍柱体积的去离子水以1.5mL/min的流速进行洗脱。
体内、体外免疫活性试验均证明ZSP可增强小鼠的免疫功能,具有明显的免疫活性。ZSP经。DEAE-SepharoseCL-6B柱分离纯化后,可得到4个组分ZSP1、ZSP2、ZSP3、ZSP4。其中由PH 5.0的醋酸盐缓冲液洗脱可得到1个中性多糖组分.ZSP1,由0-1.5 mol/LNaCL(配制于磷酸缓冲液)线性梯度洗脱得到3个酸性多糖ZSP2、ZSP3、ZSP4。ZSP1、ZSP2、ZSP3、ZSP4分别占总洗脱量的29.3%、17.6%、37.2%、15.9%,其中ZSP1、ZSP3、ZSP4中含有蛋白质。ZSP经DEAE-SepharoseCL-6B柱分离纯化后,多糖的回收率达83.1%。结合得率及体外活性试验结果,从中筛选出ZSP3、ZSP4作为进一步研究的组分。 ZSP3组分经过凝胶色谱柱SepharoseCI-6B洗脱分离,得到3个相对分子质量不同组分ZSP3a、ZSP3b、ZSP3c,它们分别占总洗脱量的9.3%、7.6%、83.1%。ZSP3经SepharoseCL-6B柱分离纯化后,多糖的回收率达90.3%。体外活性试验结果,确定ZSP3c为主要的活住成分。凝胶层析、HPLC及琼脂糖电泳三种方法鉴定表明ZSP3c组分为均一组分。ZSP3c的旋光度[α]<,D><25>=+131°(c 0.1;H<,2>O),ZSP3c组分的平均相对分子量为1.6×10<5>Da。
ZSP4组分经过凝胶柱色谱柱SepharoseCL-6B洗脱分离纯化后,得到两个相对分子质量不同组分ZSP4a、ZSP4b,它们分别占总洗脱量的43.5%、56.5%。ZSP4经SepharoseCL-6B柱分离纯化后,多糖的回收率达85.7%。ZSP4b对体外脾淋巴细胞具有显著的促进增殖功效。ZSP4b经凝胶层析、HPLC方法鉴定为均一性组分,其平均相对分子量为1.4×10<5>Da。
采用红外傅立叶转换光谱测定了ZSP3c的酯化度。在建立果胶的酯化度(DE)与A1730/(A1730+A16301之间的线性回归方程的基础上(R<2>=0.9862),通过回归计算得出了ZSP3c的酯化度为41.85%。通过分析ZSP3c的单糖组成、红外光谱、NMR谱图、甲基化结果,推测.ZSP3C是由←4)一α-GalpA(1→通过O-4位与→2)-α-Rhap(1→、→2,4)-α-Rhap(1→连接形成主链,主链中的-→2,4)-α-Rhap(1→通过O-4与其它糖残基连接形成支链;→6)-β-Galp(1→、→5)-α-Araf(1→聚合形成半乳聚糖和阿拉伯聚糖是ZSP3C侧链的主要组成,其支链通过Gal残基和Ara残基的O-1位与主链的Rha残基的O-4相连。侧链-6)-β-Galp(1→构成的半乳聚糖通过O-3、O-4产生分支,侧链→5)-α-Araf(1→构成的阿拉伯聚糖通过O-3产生分支。通过刚果红实验可知,ZSP3c是一有序的三股螺旋。
ZSP4b是一种蛋白聚糖,其蛋白质含量9.7%,主要由天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸组成,它们占总氨基酸的62.8%;其糖含量83.5%,糖基组成分析结果表明,ZSP4b是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖组成,其摩尔比为13.8:4:3:8;其糖键与肽键以O-型糖肽键相结合。
同时,本论文研究了五种枣的抗氧化性。枣提取物氧化作用随枣的品种的改变而变化,五种枣提取物抗亚油酸过氧化能力、清除DPPt{咱由基的能力以及还原力的强弱顺序依次为:金丝小枣、牙枣、尖枣、骏枣和三变红枣;五种枣提取物的总酚含量与总的抗氧化能力没有相关性。