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PHB是石化基塑料的绿色替代品,一种可降解的3-羟基烷酸酯,不同聚合度展现出不同的应用特性,具有广阔的应用前景。菌果聚糖（Levan）是一种天然的果糖聚合物,不仅是一种重要的益生元多糖,而且还具有抗肿瘤、糖尿病和免疫刺激等生物活性。但是,目前低生产性能制约了PHB和Levan的商业量化生产。有必要构建一座精细化调控的细胞工厂以降低其生产成本、提高产率,而且生产过程中的副产物的利用也值得注意。代谢工程能够通过控制代谢路径流量、碳通路流向、流速最终决定合成路径的产量及生产强度,酶工程同样为挖掘新代谢路径提供了理论技术支持。因此,本论文以大肠杆菌为底盘微生物,在构建高效表达系统的基础上,以PHB合成路径的异源表达为出发点,发展出基于代谢工程改造的Levan的联产、基于压力应答Rpp和s RNA的全局代谢调控、基于Cre重组酶的动态调控等策略,从而实现目标产物合成路径的放大,生产成本的降低,目标化合物的精细生产以及细胞生长与产物合成的平衡。同时,采用菌果聚糖合成酶新基因表征,并通过仿生矿化技术提高了Levan的产率,也为后续Levan的制备及实现与PHB的更高效联产奠定基础。在此基础上,实现了大肠杆菌细胞工厂体内体外的生产性能的优化。主要研究结果如下:1)构建了新型大肠杆菌双表达载体,并实现PHB的高效制备。以大肠杆菌BL21（DE3）为出发菌株,构建了一条PHB的合成路径。基于不同目的基因的表达需要考虑启动子的适配性的问题,构建了一个在正反链包含不同启动子的双表达载体p ANY4。运用该载体,在一次克隆当中,可以得到两个受不同启动子（T7启动子和温度敏感p R/p L启动子）调控基因表达的重组质粒,从而可以平行比较不同启动子作用下的蛋白表达和产物生成效果。另外,本研究还在拆分双启动子p R/p L基础上,首次揭示了单独温敏启动子p R和p L之间没有显著的启动效率的累积效应。通过简并PCR构建启动子优化位点饱和突变体库,使启动子的启动水平提高2倍,达到甚至超过T7启动子表达水平。在此基础上,构建了含有不同启动子的PHB表达质粒:p ANY4-T7-PHB和p ANY4-p L18-PHB,获得了高达3.21 g/L的PHB产量。相关研究也为后续研究奠定了基础。2)利用不同碳源实现了PHB的高效制备和Levan与PHB的有效联产。首先通过结合CRISPR/Cas9和λ-Red重组技术敲除了大肠杆菌pts G基因,解除了大肠杆菌在碳源利用方面存在的葡萄糖抑制机制。在此基础上,通过评估大肠杆菌BL21（DE3）（Δpts G）对各种碳源的利用效果,发现木糖和果糖展现出良好的PHB合成能力。在此基础上,利用葡萄糖+木糖和葡萄糖+果糖作为糖源,利用工程菌株进行了PHB制备。结果表明,在不同碳源条件下,敲除pts G基因使得PHB的产率提高约15-25%,表明pts G的敲除有利于不同碳源条件下PHB的合成。另外,本研究还克隆和异源表达了厌氧菌来源的新型菌果聚糖合成酶。结果表明,蔗糖的转化率高达96.1%,而Levan的产率高达52.2%。含有以上两种代谢途径的大肠杆菌最终以蔗糖为底物进行联产,最终同时获得4.8 g/L的PHB产量和高达47.9%的Levan产率。3)基于Rpp启动子和小RNA全局代谢调控提高PHB产量。基于p ANY4-p L18-ccd B的启动子双向性,开发了一种压力应答启动子Rpp的系统,响应大肠杆菌细胞密度,正向表达PHB合成相关基因,反向表达全局调控因子Ryh B和Fsr A,通过下调琥珀酸脱氢酶的表达从而积累辅因子,PHB表达量提升至72.1%,并最终实现4.92 g/L PHB的积累。4)采用大肠杆菌动态调节策略,进一步提高PHB产量。设计了动态开关实现细胞生长和PHB代谢合成路径的动态平衡。首先利用双重敲除系统敲除了乙酸代谢支路pox B基因和pta基因,减少了碳源浪费;然后,基于Cre重组酶、Rpp压力应答启动子、响应不同温度上调基因的温敏启动子,将大肠杆菌代谢分为细胞生长、37℃Lox P位点内基因切除、40℃PHB合成三个模块。然后通过优化Cre重组酶起始密码子提高了开关的严谨性,通过检测荧光信号证明了动态开关的可控性和可移植性,最终实现了5.62g/L的PHB产率,比对照提高了1.7倍。5)基于多功能His-ELP-intein标签实现SacB等蛋白的高活性表达和简易纯化。将经典纯化标签His-tag与ELP-intein tag相结合,构建了一个多功能的His-ELP-intein tag融合蛋白表达系统,兼具His-tag和ELP-intein tag的纯化能力,而且在不影响酶活性的前提下,使得纯化后的蛋白溶于无咪唑并且无高浓度盐的溶液中,方便了胞外Levan的高效制备。6)建立了一种基于非色谱柱蛋白纯化和基于CaHPO4的酶仿生矿化新策略,进一步提高胞外Levan产率。考虑到Levan的商业价值,将菌果聚糖合成酶Sac B利用基于CaHPO4的仿生矿化技术,制备成具有介孔结构的绣球花状纳米花球,展现出相对于对照254.3%的催化能力、更高的底物亲和力以及稳定性。该材料可以实现96%的底物蔗糖转化率和58%的Levan产率,并且重复使用10次后保有75%的剩余活性。另外,该材料还能将不同果汁中75%的蔗糖催化分解,从而在功能性果汁行业具有应用前景。