研究背景DNA损伤的累积是导致细胞癌变的重要影响因素[1-2],与癌症早期的发生密切联系。DNA损伤修复相关基因,被称为肿瘤三大基因之一,共同存在于正常的细胞中,参与调节细胞正常的生长、分化和增殖。有报道表明DNA损伤修复基因异常[3-5],与恶性肿瘤的演变、侵袭以及对放化疗抵抗等均有着密切关联。锌指蛋白146（Ring Finger Protein 146,RNF146）是一种与DNA损伤和修复有关的因子,通过促使不同肿瘤相关蛋白,如Axin[8]、β-catenin[8-9]、PARP1[10-12]发生泛素化降解,参与调控多种恶性肿瘤生长、侵袭、转移的病理进程。然而RNF146与脑胶质瘤的关系鲜有报道。为了确认RNF146在促进人中枢神经系统胶质瘤增殖中的重要研究价值,本课题研究第一部分我们应用了美国癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）[13-14]检索了RNF146的mRNA的表达与脑胶质瘤患者的相关临床数据进行相关性比较,利用脑胶质瘤组织芯片的免疫组化染色从蛋白水平对检索TCGA数据库所得的检索结果进行了确认,为后续的机制研究奠定了基础。小动物活体荧光成像是肿瘤动态研究的重要工具。目前常用的荧光成像原理主要集中在荧光蛋白或荧光染料标记下的直接成像或在肿瘤细胞标记荧光素酶（luciferase,luc）催化底物形成的间接成像等。后者因具有灵敏度高、穿透性强、非侵入和易操作等优势,被广泛应用于肿瘤增殖和转移的研究[15-17]中。为明确RNF146在胶质瘤增殖中的作用,本研究中我们以经萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase,Fluc）标记的小鼠胶质瘤稳转细胞株GL261-luc为对象复制荷瘤小鼠模型,通过体外基因修饰技术敲减RNF146在GL261-luc中的表达,根据表型变化明确RNF146与胶质瘤发生的关系（第三部分）。然而在外源性基因导入或目标基因敲除过程中常常出现脱靶或其他重要基因功能异常的风险。那些本应稳定表达荧光素酶或荧光蛋白的肿瘤细胞稳转株中荧光素酶或荧光蛋白表达常常不再稳定,酶活性降低、蛋白表达异常或多次传代后重要发光物质丢失[49],都会严重影响活体荧光检测效率。因此经体外基因修饰的肿瘤细胞在活体种植前有必要进行体外荧光成像能力的检测。我们在复制RNF146敲减的GL261-luc荷瘤小鼠模型前,为保证活体生物荧光成像效果,提前对luciferase标记的胶质瘤细胞GL261-luc进行荧光素酶表达效率、活性及稳定性鉴定（第二部分）。上述工作在了解RNF146在脑胶质瘤发生发展中作用的同时,为体外基因修饰对荧光标记细胞活体成像影响的研究提供理论补充。第一部分 DNA损伤修复因子RNF146在人脑胶质瘤发生发展中的作用目的研究DNA损伤修复因子RNF146表达水平与胶质瘤患者的年龄、不同病理分级和预后之间的相关性。方法从TCGA数据库中筛选515例低分级脑胶质瘤（Brain Lower Grade Glioma,LGG）（Ⅰ-Ⅲ级）和 152 例恶性胶质瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）（Ⅳ级）RNA-seq Level3数据,脑胶质瘤样本中RNF146表达在不同年龄（≤46岁和>46岁）、不同病理类别及不同病理级别（Ⅰ-Ⅲ级和Ⅳ级）间的差异性比较使用Mann-Whitney U检验法;RNF146表达的高低与临床病人数据资料的比较使用Spearman’s检验法;RNF146表达的高低对患者生存时间所产生的影响的检测方法使用Kaplan-Meier方法。对组织芯片（正常脑组织3例、低分级脑胶质瘤23例、高分级脑胶质瘤64例）分别进行RNF146免疫组化分析,然后采用Spearman’s检验法进一步验证RNF146在不同性别、年龄、病理分级中的表达差异及其与预后的相关性;Kaplan-Meier以及COX回归分析RNF146表达水平对脑胶质瘤病人生存期的直接影响。结果TCGA数据库分析提示,RNF146表达水平在>46岁患者组中显著低于<46岁组（P<0.001）;RNF146表达水平在不同性别中无明显差异（P>0.05）;GBM组RNF146的表达水平显著低于LGG组（P<0.001）。胶质瘤芯片RNF146免疫组化染色表明中低级别（Ⅰ-Ⅱ级）脑胶质瘤中RNF146的表达水平显著高于高级别（Ⅲ-Ⅳ级、GBM）脑胶质瘤（P<0.001）。按照IHC评分把RNF146表达水平划分为高、低表达两组,87%（20/23）的中、低级别的胶质瘤病例中RNF146为高表达,91%（58/64）的高级别脑胶质瘤病例中RNF146显著地低表达。Kaplan-Meier分析结果表明RNF146低表达的脑胶质瘤病人总的生存时间比RNF146高表达的脑胶质瘤患者显著缩短（P<0.001）。结论通过TCGA数据库检索结合RNF146的组织芯片免疫组化染色,我们首次提出RNF146的表达水平是影响脑胶质瘤患者预后及生存期的独立负性因素,RNF146水平降低提示患者预后较差,并且与恶性脑胶质瘤密切相关,与患者生存期降低密切相关。第二部分 RNF146敲减对GL261-luc细胞荧光素酶活性与稳定性的影响目的观察干涉病毒下调RNF146表达对荧光素酶稳定转染的小鼠胶质瘤细胞株GL261-luc中荧光素酶蛋白稳定性及活性的影响。方法采用慢病毒感染（无关病毒感染作为阴性对照）的方法下调荧光素酶稳转胶质瘤细胞株 GL261-luc 中 RNF146 表达,通过 real-time PCR（GAPDH 为内参）以及 Western-blot（β-tubulin为内参）确认RNF146的干涉效率。采用Western-blot观察病毒感染对GL261-luc细胞荧光素酶蛋白表达的影响。通过荧光素酶报告基因学检测体系观察慢病毒感染基因片段的整合对荧光素酶活性及稳定性的影响。结果和GL261以及ShRNA-Scramble组相比,ShRNA-RNF146在RNA水平及蛋白水平均明显下调（P<0.001）。下调RNF146对GL261-luc细胞中荧光素酶蛋白表达影响无显著性差异（P>0.05）。GL261-luc细胞荧光素酶的活性与细胞数呈强正相关;下调RNF146前后的GL261-luc细胞荧光素酶的活性（P>0.05）与传代（30代）后的稳定性（P>0.05）均无明显差异。结论通过干涉病毒感染下调GL261-luc细胞中RNF146的表达不影响细胞荧光素酶的表达、活性及传代后的稳定性。该细胞模型可以用于后续小动物生物荧光成像。第三部分 基于萤火虫荧光素酶的小鼠活体成像在RNF146促脑胶质瘤增殖研究中的应用目的应用基于萤火虫荧光素酶（Fluc）的小动物活体成像技术,观察RNF146对荷胶质瘤（GL261-luc）小鼠肿瘤增殖的影响。方法将5周龄的雌性BALB/c Nude裸鼠随机分为四组,每组8只。分别接种处于对数生长期的 GL261-luc、shRNA-scramble/GL261-luc 及 shRNA-RNF146/GL261-luc 的细胞于裸鼠右侧背部皮下,并设置假手术组（PBS）。一周后行小动物活体成像,腹腔内注射荧光素钾盐,记录荧光面积及单位面积荧光强度,评价RNF146对胶质瘤在体内的增殖速率及增殖活性的作用,每周检测一次,动态观测4周。记录小鼠存活时间,对荷瘤小鼠生存期进行分析。HE染色观察恶性肿瘤组织形态学的改变;通过免疫组化染色方法了解不同分组的小鼠胶质瘤中RNF146及标志性纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP）的表达情况。结果shRNA-RNF146/GL261-luc组荧光面积（P<0.001）及单位面积荧光强度（P<0.001）均显著高于GL261-luc及shRNA-scramble/GL261-luc,该组小鼠生存时间明显下降（P<0.001）。GL261-luc以及shRNA-scramble/GL261-luc组肿瘤形态及大小无明显差异（P>0.05）。免疫组化显示shRNA-RNF146/GL261-luc组RNF146及GFAP的表达分别较其余两组下降2.7倍（P<0.001）和2.6倍（P<0.001）。结论RNF146下调显著促进脑胶质瘤增殖及缩短荷瘤小鼠生存期。