论文部分内容阅读
目的:肝肾综合征（HRS）是在肝衰竭基础上出现的功能性肾衰竭,是晚期肝病较为常见的严重并发症之一,重症肝炎、肝硬化者合并HRS的一般预后极差,病死率高达约70%。尽管临床上对已发生HRS的病人积极地采取扩容、收缩血管等治疗措施,但绝大部分病人肾功能仍然无法改善[1]。肝硬化的患者HRS的发展预示着预后差,如不进行肝移植,通常肾功能衰竭进行性加重,导致死亡[2]。目前认为,HRS是肾脏循环体系中血管收缩系统被激活的结果[3]。RASMCs的功能状态直接影响肾入球小动脉的舒缩。细胞胞浆游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高与肾小球系膜细胞（GMCs,glomerular mesangial cells）及大鼠动脉平滑肌细胞（Rat arterial smooth muscle cells,RASMCs）收缩密切相关。严重肝损伤发生时,患者体内收缩血管的活性物质明显增加[4,5]。这些物质具有能够引起许多组织细胞内三磷酸肌醇（IP3）增加,与IP3Rs结合,使细胞内钙释放,进而导致肾动脉平滑肌细胞、肾小球系膜细胞收缩。通过阻断剂可以抑制上述反应,而肝素是一种易于获得的,价格低廉的临床常用药物,它能够竞争性地阻断IP3诱发的钙离子释放[6,7],但是肝素也存在诸多的不良反应,出血,多由过量所致。其膜通透性较差,需要较大的用量方能起到治疗作用,因此限制了其在相关方面的临床应用。如果能够通过药物载体将肝素仅仅作用于靶向部位,减少不良反应,则可为临床上能够开展靶向治疗肝肾综合征提供可能。四氧化三铁纳米粒子是一种价格低廉的纳米粒,化学性质比较稳定,由于毒性很小、可进行表面包被,是目前应用最广泛的磁性纳米材料[8,9]。研究发现,肝素可以与经过表面修饰的表面含有氨基及羧基的纳米粒子相连接[10-12]。Kyoung Ah Min等人发现通过将甘氨酸吸附于磁性纳米粒表面,然后通过聚合甘氨酸与肝素的电荷吸附反应将肝素吸附于纳米粒子上,在磁场的作用下,其通过细胞膜及聚酯膜的能力增加了100倍。[13]如果能通过载药系统,靶向的将肝素转运至肾脏,并能改善其膜通透性,使得其更容易进入细胞内,阻断IP3Rs诱发的钙离子释放,抑制血管收缩,则可减少肝素用量,增加疗效,减少副作用的发生,增加耐受性又可以达到阻断肝衰竭大鼠TNFα诱导的IP3Rs表达通路,从而对肝肾综合征起到治疗效果。材料与方法:1、材料1)实验对象大鼠肾小球系膜细胞（RGMC,HBZY-1）,为CCTCC,中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection）获取。SPF级别雄性SD大鼠,体重140 g±5 g,购自辽宁长生生物技术有限公司,动物合格证号:SCXK（辽）-2015-0001。2)主要试剂DMEM高糖培养液、标准胎牛血清,Hyclone公司;Alzet-mini-Osmotic pumps Model 2001,Durect公司;再生纤维素透析袋MWCO1000,联合碳化公司;HEPES,Solarbio公司;一次性水系针头过滤器,sartorius公司;免疫沉淀试剂盒,Millipore公司;羧基化Fe3O4磁性纳米粒试剂盒,美国Ocean Nano Tech公司;肝素,上海麦克莱公司（Shanghai Macklin Biochemical Co.LTD）;肝素抗II因子活性检测试剂盒,法国HYPHEN Bio Med,MTS试剂盒,promega公司;琼脂糖,sunshine Bio公司;Trizol试剂,Invitrogen公司;D-Gal N（D氨基半乳糖）、LPS（脂多糖）、FITC标记菊粉（FITC-Inulin）、DMSO,Sigma公司;Real-time PCR引物合成,Takara公司;逆转录试剂盒Ex Script TM RT Reagent Kit、PCR试剂盒SYBR（?）premix EX Taq TM（Ta Ka Ra）,Takara公司;OCT冷冻切片标本包埋剂,SAKURA公司;Fura-2AM,苏木素伊红染色试剂盒,Beyotime公司;大鼠ET-1,上海丰寿实业有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒,Pierce公司;Enhanced chemiluminescence（ECL）试剂盒,IP3R1抗体,Cell Signaling Technology公司;兔抗人β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购至Santa Cruz公司;Pierce公司。2、方法1)羧基化Fe3O4磁性纳米粒与肝素根据EDC/NSH催化反应方案完成载药反应,1%琼脂糖凝胶电泳比较反应前后载药纳米粒电泳情况。2)TEM观察载药前后纳米粒形态委托青岛科标技术研发中心。3)载药前后磁性纳米粒红外光谱（FTIR）委托上海微谱化工技术服务有限公司检测。4)通过抗II因子活性法测间接测定肝素纳米粒载药率。5)MTS法研究磁性纳米粒及载药纳米粒对HBZY-1细胞增殖率的影响。6)经细胞与普通纳米粒,肝素纳米粒共培养,通过检测细胞内铁含量明确纳米粒入胞效率。7)应用western blot研究载药纳米粒对HBZY-1中IP3R1蛋白的表达影响。8)应用realtime PCR检测载药纳米粒作用后HBZY-1中IP3R1 mRNA情况。9)通过细胞内钙测定研究载药纳米粒对HBZY-1内Ca2+释放的影响。10)构建急性肝衰竭肾损伤动物模型:给药造模前5天将含有FITC-Inulin的微渗透泵植入大鼠腹腔,每侧一枚,并于肾区皮下植入汝铁硼永磁铁（1.1T）。5天后体重恢复的大鼠进行肝衰竭造模（生理组除外）,造模剂量D-Gal N 800 mg/kg+LPS32μg/kg,给药体积均为5 ml/kg。随即将大鼠随机分5组,每组10支,并按不同分组尾静脉给药,死亡大鼠无法采血,仅仅计算死亡时间。11)HE染色法染色肝脏组织及肾组织,光镜下观察肝病理改变;观察肾脏组织结是否发生结构性改变,证明肝衰竭及功能性肾衰竭存在。12)检测血清肌酐（Cr）,丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、钾离子（K+）、钠离子（Na+）及氯离子（Cl-）。13)应用荧光酶标仪检测血清荧光强度,根据公式GFR=R/[Iss][16]计算GFR,GFR1(ml·min-1);GFR2=GFR1/BW（BW为大鼠体重kg）;GFR3 ml·min-1·g KBW-1,GFR3=GFR1/KW（KW为大鼠双肾重量g）,观察Hep-MNP,肝素等药物对急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率的影响。14)提取肾小球,通过肾小球菊粉容积测量（GIS）方法,测量ET-1作用前后肾小球容积变化（GIS1/GIS2）,间接反映肾小球血管收缩情况。15)提取肾小球,通过肾小球内钙测定,检测ET-1作用前后肾小球内钙水平,通过肾小球内钙升高倍数反映肾小球内钙释放情况。16)Western blot、Real-time PCR方法检测各组大鼠肾小球IP3R1蛋白及其mRNA的表达情况。结果:1、羧基化磁性纳米粒（Fe3O4-COOH,MNP）与肝素通过EDC/NHS催化反应:反应产物Hep-MNP与MNP相比,琼脂糖凝胶电泳均可见明显拖尾,0.5小时后距离明显。反应产物放于磁力架中分离,24小时后可见通过磁性分离作用可以实现Heparin-MNP与上清液的分离。2、通过TEM观察载药前后纳米粒形态结构:MNP直径约15 nm,分散分布,无明显凝聚现象,Hep-MNP直径约为15～18 nm,分散分布,分布情况较MNP有改变,凝聚情况不明显。3、FTIR方法验证反应产物:与MNP的FTIR谱图相比,Hep-MNP的FTIR谱图出现了肝素的部分特征峰。4、磁性纳米粒的载药率:载药反应产物MNP与肝素比值约为每毫克载药能力约8.02单位,抗凝活性每毫克纳米粒的抗凝作用于3.08单位肝素抗凝作用相当。5、MTS法进行Hep-MNP及肝素（几种浓度肝素）,MNP对HBZY-1细胞增殖率影响的研究:与生理盐水对照组相比Hep-MNP,MNP 1单位每毫升,5单位每毫升两个剂量组HBZY-1细胞增殖活性均无明显降低（P>0.05）。6、经过对于对细胞内铁含量的测定发现肝素包被可以加快纳米粒入胞速度,磁场可以加速MNP及Hep-MNP。7、Hep-MNP及肝素、MNP对HBZY-1细胞IP3R1蛋白表达的影响:Hep-MNP、肝素及MNP组IP3R1蛋白表达水平与NS+TNF组比较无明显差异（P>0.05）,较生理盐水组明显升高（P<0.01）。8、Hep-MNP及肝素、MNP对HBZY-1细胞IP3R1 mRNA表达的影响:Hep-MNP、肝素及MNP组IP3R1 mRNA水平与NS+TNF组比较无明显差异（P>0.05）,较生理盐水组明显升高（P<0.01）。9、Hep-MNP及肝素、MNP对HBZY-1细胞内钙离子释放的影响:肝素及Hep-MNP能够抑制细胞内钙离子的释放（P<0.05）。而MNP与对照组无差别（P>0.05）。10、各组死亡率差别无统计学意义。11、肝脏及肾脏形态学及组织病理检查结果:D-Gal N/LPS联合给药造模后12h肝脏明显充血肿大,呈暗红色或蓝紫色龟裂花斑样,可见弥漫出血点,肝叶粘连,切面有暗红色淤血溢出,质地极脆,易碎,部分切开包膜后无法保持自身形态。各实验分组大鼠的肾脏略增大,色泽细腻红润,表面光滑,质地软。肾体积增大,光镜下观察肾结构未见明显异常。12、血清生化学指标检测结果:血清生化检测结果显示,G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+肝素组及G/L+Hep-MNP组在造模12h后,ALT、AST与生理组比较明显升高（P<0.05）,G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+heparin组、G/L+Hep-MNP组Cr较生理组升高（P<0.05）,其中G/L+heparin组及G/L+Hep-MNP组降低（P<0.05）。G/L+MNP组Cr值与NS组相比无明显差异（P>0.05）,各组之间K+,Na+,Cl-未见明显统计学差异（P>0.05）。13、各组大鼠GFR:G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+肝素组及G/L+Hep-MNP组较生理组显著降低（P<0.05）;G/L+Hep-MNP组及G/L+heparin素组GFR1、GFR2、GFR3有改善（P<0.05）,相比G/L+heparin组有所改善,但无统计学意义（P>0.05（0.10））。14、比较各组ET-1刺激后肾小球内钙浓度升高倍数比,反应血管活性物质作用后肾小球细胞内该释放:G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+肝素组较生理组显著肾小球内钙浓度较基线升高倍数比与生理组（1.34±0.126）相比明显升高（2.41±0.55,P<0.05;2.11±0.44,P<0.05,1.82±0.58,P<0.05）,G/L+Hep-MNP组与生理组相比变化不大（1.44±0.18,P>0.05）,G/L+Heparin组及G/L+Hep-MNP组较G/L+NS组及G/L+MNP组肾小球内钙浓度升高倍数比明显降低（P<0.05）。Hep-MNP组较肝素组相比改善更明显（P<0.05）。15、比较各组ET-1作用后及作用前GIS变化（GIS2/GIS1）间接反映肾小球血管收缩/舒张情况:NS组及MNP组GIS变化与生理组相比明显升高（P<0.05）,G/L+heparin组及G/L+Hep-MNP组GIS变化较G/L+MNP组及NS组明显降低（P<0.05）,G/L+MNP与G/L+NS组比较没有明显差异（P>0.05）。G/L+heparin组与G/L+Hep-MNP组对比没有差异（P>0.05）。16、G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+heparin组及G/L+Hep-MNP组IP3R1mRNA表达比生理组明显升高（2.31±0.14,P<0.05;2.24±0.10,P<0.05）。4组比较无明显差异（P>0.05）。17、G/L+NS组、G/L+MNP组、G/L+heparin及G/L+Hep-MNP组IP3R1蛋白表达比生理组明显升高(P<0.05=。各组间没有明显差异（P>0.05）。结论:1、可以通过EDC/NHS催化反应成功构建磁性纳米粒载药体系,载药纳米粒无明显细胞毒性及抑制细胞增殖作用,且增强膜通透能力;2、Hep-MNP中每毫克纳米粒可以携带约8单位肝素,抗凝活性相当于每毫克纳米粒3单位肝素水平。对于IP3R1 mRNA及蛋白表达无明显影响,但是可以影响钙离子释放,降低细胞内钙浓度;3、急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率较生理盐水组明显降低,肌酐明显升高,而Hep-MNP及肝素可以明显改善急性肝衰竭大鼠的GFR及肌酐水平。