目的:各种原因导致的急性肝功能衰竭（ALF）在我国很常见[1],常伴发多种并发症[2],肝肾综合征（HRS）是其中之一。严重肝损伤发生时,患者体内收缩血管的活性物质及TNF-α明显增加[3-4],TNF-α通过增加PKC-α活化上调肾小球平滑肌细胞和系膜细胞内1型1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R1）表达,导致对血管活性物质的反应性异常增高,造成肾灌流压增高,滤过率下降[5-7],导致进行性、功能性肾衰竭[8]。慢病毒沉默PKC-α基因可以通过抑制TNF-α诱导的IP3R1表达,明显改善暴发性肝衰竭大鼠肾小球滤过率[9]。既然在急性肝衰竭肾小球滤过率降低动物模型中,影响肾小球平滑肌细胞及系膜细胞收缩的信号转导途径中PKC-α起着重要的作用,我们设想是否可以将PKC-α抑制剂safingol应用于急性肝衰竭大鼠,研究其是否可以通过阻断上述通路,改善急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率。由于safingol剂量依赖性的血管刺激、溶血、血尿、肝肾损伤等[10-11],目前safingol应用于临床仍存在困难[11]。能否找到一种载体,可以实现对safingol的载药,通过增加细胞对safingol的摄取,及增加肾脏局部药物浓度,从而减少全身safingol用量,减少safingol全身的毒副作用呢?目前没有理想的特异靶向肾脏的配体结合位点,但肾血流量大,肾系膜细胞有一定吞噬功能,有一些研究尝试用磁性纳米粒,利用体外磁场达到增加肾脏的药物聚集[12,14],并可以增加肾小球系膜细胞对药物的摄取率[15]。故我们尝试选择磁性纳米粒（MNP）作为载药系统。本研究中我们首先通过EDC/NHS催化反应完成载药,然后将载药纳米粒及safingol作用于大鼠肾小球系膜细胞（RGMCs）,研究其对PKC-α活化、IP3R1蛋白表达及细胞内钙释放的影响,最后通过体内试验研究载药纳米粒是否可以影响急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率。材料与方法:1、材料1)实验对象大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）,为ATCC引进,ATCC号为CRL-2573。SPF级别雄性SD大鼠60只,体重90g±5g,购自辽宁长生生物技术有限公司,动物合格证号:SCXK（辽）-2015-0001。实验前,予大鼠分笼饲养,室温控制在23±3℃,间隔12h开灯照明。SPF级饲料（购自辽宁长生生物技术有限公司）,自由饮水,饲养3天后用于实验。2)主要试剂PKC-α抗体、磷酸化PKC-α（P-T638）抗体,Bioworld公司;IP3R1抗体,Cell Signaling Technology公司;兔抗人β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购至Santa Cruz公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒,Pierce公司;Enhanced chemiluminescence（ECL）试剂盒,Pierce公司;DMEM高糖培养液、标准胎牛血清,Hyclone公司;D-Gal N、LPS、FITC标记菊粉（FITC-Inulin）、DMSO,Sigma公司;Alzet-mini-Osmotic pumps Model 2001,Durect公司;再生纤维素透析袋MWCO1000,联合碳化公司;HEPES,Solarbio公司;一次性水系针头过滤器,sartorius公司;免疫沉淀试剂盒,Millipore公司;羧基化Fe3O4磁性纳米粒试剂盒,美国Ocean Nano Tech公司;Safingol,Calbiochen公司;普鲁士蓝染色试剂盒,solarbio公司;MTS试剂盒,promega公司;琼脂糖,sunshine Bio公司;Pep Tag RAssay for Non-Radioactive Detection of Protein Kinase C Kit,Promega公司;Trizol试剂,Invitrogen公司;Real-time PCR引物合成,Takara公司;逆转录试剂盒Ex Script TM RT Reagent Kit、PCR试剂盒SYBR（?）premix EX Taq TM（Ta Ka Ra）,Takara公司;OCT冷冻切片标本包埋剂,SAKURA公司;Fura-2AM,苏木素伊红染色试剂盒,Beyotime公司;大鼠ET-1,上海丰寿实业有限公司。2、方法1)羧基化Fe3O4磁性纳米粒与safingol根据EDC/NSH催化反应方案完成载药反应,1%琼脂糖凝胶电泳比较反应前后载药纳米粒电泳情况。2)TEM观察载药前后纳米粒形态委托青岛科标技术研发中心。3)载药前后磁性纳米粒红外光谱（FTIR）委托上海微谱化工技术服务有限公司检测。4)通过高效液相色谱（HPLC）测定上清液safingol浓度委托青岛科标技术研发中心,计算磁性纳米粒的载药率。5)MTS法研究磁性纳米粒及载药纳米粒对细胞增殖率的影响。6)细胞爬片普鲁士蓝染色研究磁性纳米粒作用RGMCs后能否进入细胞。7)应用PKC-α非放射性体外磷酸化法研究载药纳米粒对RGMCs中PKC-α活性影响。8)应用western blot研究载药纳米粒对RGMCs中PKC-α、PPKC-α、IP3R1蛋白的表达影响。9)应用realtime PCR检测载药纳米粒作用后PKC-α、IP3R1 mRNA情况。10)载药纳米粒与不同浓度Safingol对肾小球系膜细胞PPKC-α表达影响的研究应用western blot。11)通过细胞内钙测定研究载药纳米粒对RGMCs内Ca2+释放的影响。12)构建急性肝衰竭肾损伤动物模型:给药造模前1周将SD大鼠植入充满FITC-Inulin的微渗透泵,并于肾区皮下植入磁场强度1.1T汝铁硼永磁体。1周后大鼠称重造模,造模剂量D-Gal N400mg/kg+LPS32μg/kg,给药体积均为2ml/kg。随即将大鼠随机分四组,每组10支,并按不同分组尾静脉给药。13)肝脏组织常规HE染色,光镜下观察肝细胞坏死情况;肾脏组织常规HE染色,光镜下观察肾脏组织结构是否发生改变。14)检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBil）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、钾离子（K+）、钠离子（Na+）及氯离子（Cl-）。15)应用荧光酶标仪测定血清FITC荧光量,根据公式GFR=R/[Iss]计算GFR,GFR1（ml·min-1）;GFR2（ml·min-1·kg BW-1）,GFR3（ml·min-1·g KBW-1）,观察载药纳米粒对急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率的影响。16)提取肾小球,通过肾小球菊粉容积测量（GIS）方法,测量ET-1作用前后肾小球容积变化（GIS2/GIS1）,间接反映肾小球血管收缩情况。17)提取肾小球,通过肾小球内钙测定,检测ET-1作用前后肾小球内钙水平,通过肾小球内钙升高倍数反映肾小球内钙释放情况。18)Western blot、Real-time PCR方法检测各组大鼠肾小球PKC-α、PPKC-α、IP3R1蛋白及其mRNA的表达情况。结果:1、羧基化Fe3O4磁性纳米粒与safingol根据EDC/NSH催化反应:反应产物MNP-Sa与MNP相比,琼脂糖凝胶电泳均未见明显拖尾,电泳结果未见明显差异。反应产物MNP-Sa放于磁力架中分离,24小时后可见通过磁性分离作用可以实现MNP-Sa与上清液的分离;2、通过TEM观察载药前后纳米粒形态结构:MNP直径约15nm,分散分布,无明显凝聚现象,表面的聚合物及功能基团层约2.5nm,MNP-Sa直径约为15-20nm,分散分布,无明显凝聚情况;3、FTIR方法验证反应产物:与MNP的FTIR谱图相比,MNP-Sa的FTIR谱图增加3219 cm-1左右的峰及1194cm-1/1105cm-1左右的峰分别代表氮氢键的伸缩振动特征出峰,及碳氮键的伸缩振动特征出峰;4、磁性纳米粒的载药率:载药反应产物MNP与safingol的摩尔比约为1:8.44;5、MTS法进行MNP-Sa及safingol对细胞增殖率影响的研究:与生理盐水对照组相比,MNP-Sa 0.125μM、0.25μM两个剂量,MNP 0.125μM、0.25μM两个剂量,safingol 5μM、10μM两个剂量组细胞增殖活性均无明显降低（P>0.05）;6、RGMCs普鲁士蓝染色:MNP-Sa处理细胞12小时后,经过普鲁士蓝染色,发现胞浆中有大量染成蓝色的颗粒,细胞核内没有蓝染的成分,而生理盐水对照组细胞内没有发现染成蓝色的成分;7、MNP-Sa及Safingol对RGMCs PKC-α、IP3R1 mRNA表达的影响:Sa及MNP-Sa组PKC-αmRNA水平与NS组比较无明显差异（P>0.05）,IP3R1mRNA的水平较NS组明显降低（P<0.01）;8、MNP-Sa及Safingol对RGMCs细胞PKC-α活性影响:Sa组、MNP-Sa组PKC-α活性明显低于NS组（P<0.05）,Sa组与MNP-Sa组之间PKC-α活性比较差异无统计学意义（P>0.05）;9、MNP-Sa及Safingol对RGMCs PKC-α、PPKC-α、IP3R1蛋白的表达影响:各组PKC-α蛋白的表达与NS对照组比较均无统计学差异（P>0.05）,MNP-Sa及Sa组PPKC-α蛋白及IP3R1蛋白的表达明显低于NS对照组（P<0.05）;10、MNP-Sa与不同浓度Safingol对RGMCs PPKC-α表达影响的比较:MNP-Sa组及safingol5μM、7.5μM、10μM组与NS对照组相比,PPKC-α表达均明显降低（P<0.05）,而safingol2.5μM组较NS对照组无明显统计学差异。MNP-Sa组与safingol浓度5μM、7.5μM、10μM组PPKC-α表达情况未见明显统计学差异（P>0.05）;11、RGMCs细胞内钙离子浓度的测定:ET-1刺激后,MNP-Sa0.125mM、Sa5mM及Sa7.5mM组RGMCs内钙升高倍数明显低于NS对照组（P<0.05）;Sa5mM及Sa7.5mM组细胞内钙升高的倍数与MNP-Sa0.125mM组相比无明显差异（P>0.05）,而Sa2.5mM组与MNP-Sa0.125mM组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;12、肝脏及肾脏形态学及组织病理检查结果:D-Gal N/LPS联合给药造模后12h大鼠肝脏明显充血肿大,呈暗红色或酱紫色花斑样,可见弥漫出血点,肝叶之间粘连,切面有暗红色淤血溢出,质地脆,易碎。光镜下肝细胞肿胀、变性、坏死,没有肝细胞再生,纤维间隔塌陷,可见红细胞填充。光镜下观察肾小球、近曲小管、远曲小管结构未见异常。13、血清生化学指标检测结果:血清生化检测结果显示（表3.1）,G/L组、G/L+MNP组、G/L+MNP-Sa组、G/L+Sa组在造模12h后,ALT、TBIL、BUN、K+与NS组比较明显升高（P<0.05）,4组间无统计学差异（P>0.05）。G/L组、G/L+MNP组Cr值与NS组相比明显升高（P<0.05）,G/L+MNP-Sa组、G/L+Sa组Cr值与NS组比较无明显统计学差异（P>0.05）。各组之间Cl-未见明显统计学差异（P>0.05）;G/L组Na+较NS组明显降低（P<0.05）,其余各组Na+与NS组相比无明显统计学差异（P>0.05）,但较G/L组明显升高（P<0.05）。14、各组大鼠GFR:G/L组、G/L+MNP组GFR1、GFR2、GFR3较NS组显著降低（P<0.05）;G/L+MNP-Sa组GFR1、GFR2、GFR3相比NS组有所降低,相比G/L组有所改善,其中GFR1、GFR3与NS组及G/L组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。G/L+Sa组GFR1、GFR2、GFR3相比NS组明显降低（P<0.05）,相比G/L组有所改善,其中GFR1与G/L组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。15、比较各组ET-1刺激后肾小球内钙浓度升高倍数比,反应血管活性物质作用后肾小球细胞内该释放:G/L组及G/L+MNP组肾小球内钙浓度升高倍数比与NS组相比明显升高（P<0.05）,G/L+Sa组及G/L+MNP-Sa组肾小球内钙浓度升高倍数比（P<0.05）与G/L组及G/L+MNP组比较明显降低,与NS组相比没有明显差异（P>0.05）。16、比较各组ET-1作用后及作用前GIS变化（GIS2/GIS1）间接反映肾小球血管收缩/舒张情况:G/L组及G/L+MNP组GIS变化与对照组相比明显升高（P<0.05）,G/L+Sa组及G/L+MNP-Sa组GIS变化（P<0.05）与G/L组及G/L+MNP组比较明显降低,与NS组比较没有明显差异（P>0.05）。17、G/L组,G/L+MNP组,G/L+Sa组及G/L+MNP-Sa组PKC-αmRNA的表达与NS组相比无明显统计学差异（P>0.05）。G/L组及G/L+MNP组IP3R1mRNA表达比NS组明显升高（P<0.05）。G/L+Sa组及G/L+MNP-Sa组IP3R1mRNA表达与G/L组比较明显降低（P<0.05）。18、G/L组,G/L+MNP组,G/L+Sa组及G/L+MNP-Sa组肾小球PKC-α蛋白的表达与NS组相比均无统计学差异（P>0.05）。G/L组及G/L+MNP组肾小球PPKC-α蛋白的表达与NS组相比明显升高（P<0.05）,G/L+Sa组及G/L+MNP-Sa组PPKC-α蛋白的表达与G/L组相比明显降低（P<0.05）。G/L组及G/L+MNP组肾小球IP3R1蛋白的表达与NS组相比明显升高（P<0.05）,G/L+Sa组及G/L+MNP-Sa组IP3R1蛋白的表达与G/L组相比明显降低P<0.05)。结论:1、应用的羧基化氧化铁磁性纳米粒可以通过EDC/NHS催化反应实现对safingol的载药,且载药后纳米粒无明显细胞毒性,可以被RGMCs摄取;2、MNP-Sa（0.125μM,约相当于携带safingol 1.1μM）及safingol（5μM）可以明显抑制RGMCs PKC-α的活化、PPKC-α、蛋白表达,下调IP3R1mRNA及蛋白表达,降低细胞内钙浓度,而不影响PKC-α蛋白及PKC-αmRNA水平;3、急性肝衰竭大鼠肾小球滤过率较生理盐水组明显降低,而MNP-Sa及Safingol可以明显改善急性肝衰竭大鼠的GFR。