嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性寄生菌。它能够广谱性地引起真核细胞感染,并且能在其侵染的宿主细胞中稳定增殖。嗜肺军团菌通常寄生在原生动物体内。人类在饮用了含有病原体的水之后会将病原体吸入肺泡粘膜,从而感染嗜肺军团菌。尽管有证据表明,嗜肺军团菌能入侵肺部上皮细胞,但是目前普遍认为嗜肺军团菌主要的侵蚀对象为肺巨噬细胞,并且能在巨噬细胞中复制和增殖。嗜肺军团菌在主要通过Ⅱ型分泌系统和Ⅳ型分泌系统,将产生的毒力因子送往宿主细胞,从而达到侵染目的。嗜肺军团菌主要的酸性磷酸酶(MapA)正是属于Ⅱ型分泌系统中的毒力因子。有证据表明,MapA可能通过影响细胞信号通路的方式促进嗜肺军团菌侵染细胞。MapA属于组氨酸酸性磷酸酶(HAP)。顾名思义,由它需要在酸性环境下,由自身关键的组氨酸位点提供催化活性。组氨酸酸性磷酸酶超家族含有一个由七个氨基酸组成的保守基序——-RHGXRXP。经研究,嗜肺军团菌90%的酸性磷酸酶活性都由MapA提供。为了进一步研究MapA的作用机制及在噬肺军团菌侵染人体中起到的作用,我们体外克隆并表达了MapA的蛋白质样品。并通过X-射线衍射法解析了MapA及其与底物及小分子抑制剂的晶体结构。通过结构分析我们发现MapA的结构和其它组氨酸酸性磷酸酶很相似,其发挥酶活性的重要位点分别为Glu201、Arg33、 Arg37、Arg101、His34和Asp281。之后的生化实验证明了G1u201和Asp281对酶活力有重大影响。为了进一步了解MapA的底物识别机制,我们解析了Asp281位点突变的蛋白质D281A结合底物5’-AMP的晶体结构,分辨率为2.9A。该D281A/5’-AMP复合物晶体显示,5’-AMP完全契合于活性口袋,其核糖的2’-羟基被Glu201稳定住,而腺嘌呤部分被His205和Phe237稳定。为了确认这些关键的氨基酸位点,我们做了一系列的定点突变体,分别为单点突变E201A, H205A,F237A以及双点突变H205A/F237A。目前我们已经得到分别以pNPP、5’-AMP、3’-AMP为底物的磷酸酶酶活实验数据；另外,我们还分别以pNPP、5’-AMP、3’-AMP为配体,进行了与MapA以及它的突变体的等温滴定量热实验,希望通过该项数据能比较出它们结合能力的差异。如我们所期望的那样,酶活实验和ITC数据的确显示出MapA与它的突变体有很大差异,也验证了那些从结构生物学角度分析的关键位点是正确的。目前,据我们所知,这是HAP结合底物的第二种模式,即MapA能使3’-AMP的嘌呤及核糖结合在活性位点上。因此,我们的研究,不仅从结构和生化角度上更加深了对该蛋白的了解,而且也使我们对整个HAP超家族结合底物的机制有了新的认识。