丹参(Silvia miltiorrhiza Bunge)是一种常见及用途广泛的传统型多年生草本药用植物。丹参的药用活性成分主要是丹参酮类和丹酚酸类化合物,活性成分含量是药材品质的关键指标,如何增加活性成分含量,从而提升药材品质是当下研究重点,阐明活性成分生物合成关键基因的转录调控机制,可为调控活性成分含量奠定理论基础。课题组前期利用丹参酮生物合成关键酶基因Sm CPS1的启动子为诱饵,酵母单杂筛选丹参c DNA文库,获得一个与Sm CPS1启动子结合的转录因子Sm WRKY40,本研究解析了Sm WRKY40在调控丹参酮生物合成中的功能和分子机制。在丹参毛状根中过表达Sm WRKY40可显著抑制丹参酮的积累,进一步地,利用RT-q PCR、酵母单杂交、凝胶迁移阻滞以及双荧光素酶报告基因等试验,揭示了Sm WRKY40抑制丹参酮生物合成的分子机制。主要结果如下:1.从丹参中克隆了Sm WRKY40基因,CDS为1059bp,编码352个氨基酸;Sm WRKY40主要在根中高水平表达,在茎和叶片中的表达水平很低;外源Me JA和SA处理可以抑制Sm WRKY40的转录;亚细胞定位试验表明,Sm WRKY40定位在细胞核。2.通过根癌和发根农杆菌介导的遗传转化获得过表达Sm WRKY40的丹参转基因植株和毛状根,HPLC试验表明Sm WRKY40过表达导致毛状根中丹参酮I和丹参酮IIA的含量显著降低;利用RT-q PCR分析了转基因材料中丹参酮生物合成基因的表达水平,发现Sm DXS2、Sm DXR、Sm MDS、Sm HMGR3、Sm GGPPS3、Sm CPS1和Sm CPS5的表达量均呈现不同程度的下调,且Sm CPS1和Sm CPS5的表达量变化较为显著,这两个基因可能是Sm WRKY40的下游靶基因。3.为解析Sm WRKY40抑制丹参酮积累的分子机制,进行了酵母单杂交实验,结果表明Sm WRKY40可以在酵母体内与Sm CPS1和Sm CPS5启动子互作;进而利用EMSA试验证实了Sm WRKY40可以体外直接结合这两个基因的启动子;双荧光素酶报告基因试验表明Sm WRKY40直接抑制Sm CPS1和Sm CPS5启动子的转录活性。综上,本研究揭示了Sm WRKY40直接抑制Sm CPS1和Sm CPS5的转录从而负调控丹参酮生物合成的分子机制。