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刺激响应性材料是指随着外界环境微小的物理或化学变化其性能可作出响应的一类材料,如光、力、温度、pH以及生物学等方面的改变。这类材料目前已在药物释放、成像造影和生物活性分子载体等领域有了广泛的应用。在目前使用的众多刺激信号源中,酶由于其高效、高选择性以及在人体中的特殊性占据了重要的地位,依据酶的特异性响应可以实现药物的定点传递和释控。偶氮苯除了具有独特的光响应性能外,也能对结肠中的偶氮还原酶响应,因此偶氮苯衍生物可以作为结肠中偶氮还原酶的活性位点而应用于生物技术。荧光探针是一种高效灵敏的生物光学探测器,在生物成像和生物传感等领域具有重要的应用前景。我们知道,由于生物体对可见光的吸收、散射以及自发荧光等原因降低了可见光区荧光探针的灵敏度;而近红外荧光吸收波长和发射波长在600～950 nm,可有效避免组织体的背景干扰,并且能渗透到组织内部而提高分析灵敏度。因此,近红外荧光探针可以高效、灵敏地在生物体内实现酶的识别、药物释放监测、生物成影造像等。相比小分子化合物,聚合物毒性低、溶解性和稳定性好,结构多样,而且可通过聚合物组装制备纳米材料。因此聚合物荧光探针具有得天独厚的优势,成为研究的热点。通过文献调查,我们发现迄今为止基于偶氮还原酶响应的近红外荧光聚合物探针鲜有报道。目前基于偶氮还原响应聚合物的研究还不够深入,实际上多数是集中在聚合物组装体的还原响应性解离,其应用研究报道不多见,而基于药物释放与荧光检测双重功能聚合物报道则更加少见。最近我们课题组率先报道了一种基于四苯基乙烯的偶氮还原酶响应聚合物荧光探针,其荧光发射波长处于可见光区域。正如上述,可见光荧光探针在生物体应用上具有一定的缺陷。因此,我们进一步地研究基于偶氮还原酶响应的近红外荧光聚合物探针,旨在拓展偶氮类聚合物在生物传感、药物释放等领域的应用;丰富偶氮还原酶响应的聚合物荧光探针的研究,以及为结肠中可视化药物靶向释放提供重要的理论依据,填补该研究领域的空白。本文设计并合成了一类偶氮还原酶响应的近红外荧光聚合物探针,我们将含偶氮苯和近红外荧光基团(BODIPY)的小分子荧光探针引入到具有生物相容性的两亲性聚合物链中,制备具有还原响应性的近红外荧光聚合物探针。将获得的聚合物与药物在溶液中共组装得到包载药物的聚合物胶束。由于荧光基团被包裹在胶束核内,聚集诱导猝灭(ACQ)效应导致无荧光发射,即荧光“关”;然而,在偶氮还原酶的作用下,偶氮键被打断,导致胶束解离,药物随之释放。偶氮键断开后,聚合物分解为亲水和亲油链,荧光基团由于连接在亲水链上而溶于PBS溶液中,消除了ACQ效应,荧光被激活,即荧光“开”,并且随着酶解进行,荧光强度大大提高。具体内容如下:1、首先设计并合成了含偶氮苯和近红外荧光基团(BODIPY)的小分子荧光探针。通过RAFT聚合得到结构精致的两亲性嵌段共聚物(PBAPMA-b-POEGMA)。随后通过迈克尔加成反应将小分子荧光探针接到聚合物侧链上,得到两亲性近红外荧光聚合物探针(P(BAPMA-co-APMA-co-RAPMA)各POEGMA)。并通过核磁共振氢谱(1H NMR),凝胶渗透色谱(GPC),紫外/可见吸收光谱(UV-Vis)等方法对聚合物的结构进行了表征。将获得的聚合物通过溶液自组装制备得到聚合物胶束,并使用透射电镜(TEM)对胶束形貌进行了表征,表明该两亲性聚合物能在PBS缓冲溶液中形成直径约30 nm的稳定球形胶束;进一步模拟结肠环境,在37℃厌氧条件下,使用连二亚硫酸钠(Na2S204)模拟偶氮还原酶加入到胶束的PBS水溶液中进行还原。通过TEM,荧光分光光度计和UV-Vis对还原前后胶束的形貌,胶束溶液的荧光和紫外-可见吸收变化进行表征。结果表明,该聚合物具有还原响应的荧光探针功能。2、首先设计并合成基于偶氮苯和近红外荧光基团(BODIPY)的小分子荧光探针,通过开环聚合以及叠氮-炔基“Click”反应将其引入到两亲性嵌段共聚合物PEG398-alAB6Azo-PLA144主链中并且连接了亲疏水链段,使用1H NMR,GPC,红外光谱(FT-IR)等手段对获得的聚合物进行详细表征。将聚合物PEG398-alAB6Azo-PLA144在DMSO与PBS混合溶液(pH=7.4)中自组装,得到荧光“关”的聚合物组装体。通过TEM以及动态光散射(DLS)对组装体的形貌、尺寸及粒径分布进行了表征,结果表明该两亲性聚合物能在PBS溶液(pH 7.4)中形成粒径约为35 nm的稳定球形胶束。进一步模拟结肠环境,在37℃无氧条件下用偶氮还原酶以及辅酶NADPH对胶束的PBS水溶液进行酶解。通过荧光分光光度计研究其荧光“开关”行为,UV-Vis观测偶氮苯的断裂情况,并且运用TEM和DLS对还原后的胶束形貌、尺寸及粒径分布进行了充分的表征。结果表明,在偶氮还原酶的存在下该组装体中偶氮苯可以完全断裂,组装体缓慢解离,而且荧光逐渐被激活,在710 nm附近具有强的荧光发射。使用正常细胞L929以及癌细胞Hela对酶解前后的胶束溶液进行了 MTT 细胞毒性测试,结果证明PEG398-alAB6Azo-PLA 144聚合物胶束以及酶解后暴露苯胺的聚合物片段皆无毒,具有良好的生物相容性。进一步将PEG398-alAB6Azo-PLA144与模型药物DOX共组装得到荧光“关”的载药胶束,并模拟结肠生理环境,在37℃无氧条件下考察了该载药胶束的偶氮还原酶响应性,通过荧光分光光度仪对药物的释放过程以及荧光强度变化进行了跟踪监测,UV-Vis对偶氮苯的断裂情况进行监测,并且运用TEM对其还原过程中的胶束形貌改变进行了跟踪表征,DLS对还原后的胶束尺寸及粒径分布进行表征。结果表明该载药胶束在偶氮还原酶存在下逐步解离,可以实现药物缓释以及近红外荧光的同步增强,在一定时间范围内可以通过监测荧光强度的改变跟踪药物的释放情况。