心脏移植作为终末期心衰最有效的治疗手段,一方面能使患者的生存率显著提高,延长患者寿命,同时,可以使患者的生活质量得到明显改善。然而,由于供心数量的严重匮乏,为心脏移植手术的开展造成极大的障碍。因此,采取适当方式来延长供心的冷缺血时间,是扩大供心获取半径和增加供心数量的可能途径。研究表明,供心的保护效果极大影响着移植后供心的功能,影响患者的预后。因此,寻找更佳的供体心脏保存方法以延长供心冷缺血时间就显得尤为重要。HTK 液(Histidine-tryptophane-ketoglutarate solution,组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐液)是目前广泛应用的离体器官冷藏保护液,可代偿心肌细胞酸中毒和延长无氧糖酵解时间,具有良好的心肌保护作用。近年来,临床研究表明,HTK液虽然有很好的心肌保护作用,但是仍然不能完全保证心脏移植手术的成功,主要是因为心脏移植手术的过程中会发生缺血/再灌注(I/R)损伤。因此,探索更有效的预防心肌缺血/再灌注损伤的心肌保护方法和研制新型心脏保护液配方是研究的热点。在我国传统中药宝库中,很多中药都有很好的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用,这使在中药中筛选出一种减轻心肌I/R损伤的中药成为了可能。研究表明甘草具有很多药理学活性,如抗心肌缺血、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和抗炎作用等。在我们的以前研究中发现,甘草中多种化合物,如甘草查尔酮B(LCB)、甘草查尔酮C(LCC)、山奈酚(Kae)和迷迭香酸(RosA)等,均有很好的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用,并且这些化合物均能显著减轻心肌I/R损伤。通过我们的研究结果,以及相关的文献报道,我们推断甘草提取物可作为传统HTK液的添加剂,可能有增强心脏保护液对心肌的保护作用,从而延长供心冷缺血时间。因此,我们在传统HTK液中分别添加RosA、Kae、LCB和LCC,形成4种新的心脏保护液,并通过大鼠供心冷缺血模型、供心心脏移植模型及大鼠心肌缺血/再灌注模型,观察其对心肌超微结构改变和移植术后大鼠生存率、心功能影响,选出增强HTK液功效最有效的药物,以及对新型HTK液通过干扰 PPAR-γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,过氧化物酶体增殖物激活受体-γ)/NF-κB的途径减轻冷缺血损伤的作用机制进行探讨。第一部分:甘草提取物延长供心冷缺血时间的研究目的以离体大鼠的供心为研究对象,通过建立供心冷缺血保存模型和心脏移植模型完成供心的灌注、保存及移植,观察含有不同甘草提取物成分的HTK液的心肌保护效果。方法将500只雄性近交系SD大鼠随机分为供体组400只、受体组100只。供体组随机分为4组,即冷缺血4h组、6h组、8h组、10h组,每组再随机分为5小组,即HTK液组、RosA组(含有15 μmol/L RosA的HTK液)、Kae组(含有15 mmol/L Kae 的 HTK 液)、LCB 组(含有 1 μg/L LCB 的 HTK 液)及 LCC 组(含有 2 mmol/L LCC的HTK液),每小组20只。受体组也随机分为4大组,每组再随机分为5小组,每小组5只。供体组400只大鼠在全麻手术下切取供心。各供心组大鼠心脏使用该组对应的含药HTK液(4℃)进行灌流停搏,心脏停搏后,立刻切取下,分别置于5种4℃的HTK液中保存4h、6h、8h、10h。冷缺血保存后,对供心进行再灌注并检测相关心功能指标(射血分数)。HE染色观察心肌组织学结构损伤,透射电子显微镜观察细胞形态学改变。同时,在不同冷缺血时间点,检测各组心脏保护液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白I(CTnI)的含量;检测移植术后供心射血分数及大鼠存活率;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色估计心肌梗死面积。结果1、随冷缺血时间的延长,5种不同HTK液中心肌梗死面积逐渐升高,并且HTK液中的心肌酶(CK-MB和CTnI)含量也逐渐升高。供心冷缺血时间6h以内,5种不同HTK液中心脏损伤数据没有显著性差异(P>0.05)。供心冷缺血时间大于6 h时,RosA组与Kae组心肌损伤程度均显著低于HTK液组(P<0.05),主要表现为:RosA组与Kae组中心肌梗死面积和HTK液中心肌酶的含量均显著低于HTK液组(P<0.05)。2、心肌细胞形态结构变化的比较:供心冷缺血时间6 h以内,在光镜下各组心肌细胞形态基本保持正常,细胞间质出现轻度水肿,肌原纤维排列整齐,有少许溶解;供心冷缺血时间超出6h以上时,细胞间质出现中度水肿,部分纤维断裂、溶解。与HTK液组相比,RosA组与Kae组心肌细胞形态结构损伤明显减轻。3、心肌细胞超微结构变化的比较:供心冷缺血时间6 h以内,电镜下各组心肌细胞膜基本完整,细胞基质轻度肿胀,肌丝、肌节结构清晰,排列整齐,细胞核无肿胀,染色质均匀,核周无水肿带;供心冷缺血时间大于6 h时,心肌细胞出现明显的损伤,少量心肌细胞有自溶现象出现,肌丝、肌节排列欠整齐,存在不同程度的紊乱,并开始出现空泡样变。RosA组显示出与其他组相比更好的心肌保护作用。4、心肌梗死面积的检测:以供心冷缺血时间8 hTTC染色为代表,HTK液组显著高于RosA组,高于Kae组、LCB组及LCC组。5、受体大鼠生存率的比较:供心冷缺血时间6 h以内,各组大鼠2个月生存率无明显差别。当供心冷缺血时间大于6 h,与HTK组相比,RosA组大鼠生存率显著提高(P<0.05),并且RosA组大鼠的心脏射血分数也显著高于HTK液组(P<0.05)。6、供心心功能的比较。与HTK组相比,RosA组在早期再灌注阶段显著改善心功能(心脏射血分数)(p<0.01)。添加Kae和LCB的HTK液也提高了心肌保护的效应(p<0.05)。结论1、随冷缺血时间的延长,心肌损伤逐渐加重,移植后供心射血分数下降,大鼠生存率降低。2、RoaA作为HTK液添加剂,具有延长心肌冷缺血时间、减轻心肌损伤、提高移植后心脏的射血分数及大鼠生存率。3、RosA组心肌保护液效果优于传统HTK液组和其他添加剂组。第二部分迷迭香酸心肌保护作用机制研究目的探讨迷迭香酸(RosA)作为HTK液添加剂增强心肌保护的作用及其机制。方法成年SD大鼠随机分为六组,假手术组(Sham组)、冷缺血/再灌注损伤组(I/R组)、RosA组、GW组(GW组,GW9662是PPAR-y的选择性阻断剂)、RosA+冷缺血/再灌注损伤组(RosA+I/R组)、RosA+GW9662+冷缺血/再灌注损伤组(RosA+GW+I/R组)。在冷缺血保存4小时后,鼠心通过Langendorff灌流系统进行复灌。血流动力学参数由生物多导记录仪检测;测定灌注前后冠状动脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)含量。灌注结束,心肌梗死面积用TTC染色进行检测;心肌组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物的比率(GSH/GSSG)用ELISA法测定;PPAR-γ和NF-κB的蛋白质的表达量通过Western blot法进行测定;心肌细胞凋亡率通过TUNEL法检测。结果与假手术组比较,I/R组心脏血流动力学参数均显著降低,心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率均显著增加,冠脉流出液中的LDH和CK含量显著升高,心肌组织中MDA、CRP、IL-6和TNF-α含量显著升高,而SOD的活性显著性降低。RosA和GW组与假手术组之间没有显著性差异。与I/R组相比,RosA+I/R组中心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率、心肌组织中SOD活性,GSH/GSSG比率和心脏血流动力学系数显著升高,冠状动脉流出液中心肌酶含量降低,心肌组织中MDA、CRP、IL-6和TNF-α的含量也显著降低。并且PPAR-γ的蛋白表达量显著性升高,而NF-κB的蛋白表达量显著降低。重要的是,RosA的上述效应几乎全部被共同添加的GW9662逆转。结论1、心脏经冷缺血保存4 h后,再灌注损伤表现为心肌收缩功能下降、心肌组织坏死加重、氧化应激水平升高、炎症因子分泌增加、细胞凋亡增加等。2、RosA作为HTK液添加剂,具有心肌保护作用,其机制可能与RosA抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡作用有关。3、RosA可能通过上调PPAR-y表达,降低NF-κB活性,进而抑制炎症反应,发挥心肌保护作用,从而延长供心冷缺血时间。