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研究背景随着医学科学技术水平的发展,癌症的检出率越来越高,治疗方法和疗效也得到了提高,生存期逐渐延长。然而,癌性疼痛却严降低了恶性肿瘤病人的生存质量。迄今为止,阿片类药物仍然是癌性疼痛治疗最有效和最常用的药物,但大剂量长时间的应用阿片类药物极易造成耐受甚至痛觉过敏。临床上还没有比阿片类药物效果更好的治疗癌性疼痛的药物,因此阿片类药物耐受是癌性疼痛治疗中急需解决的棘手问题。目前单纯吗啡耐受动物模型几乎是国内外关于阿片耐受的研究的全部基础,但此动物模型并不能与癌性疼痛临床情况完全相符合。癌痛是最复杂的慢性疼痛,既有炎症痛和神经病理性疼痛的参与,又比二者而复杂的多。所以要想深入的研究癌痛吗啡耐受机制,必需建立能模拟临床实际情况的动物模型。趋化因子是参与免疫细胞募集、成熟和激活的重要介质,其化学成分是分泌型的小分了量蛋白质(约8～12 ku),。有研究发现趋化因子 MCP-1在疼痛的产生和维持过程中发挥重要的作用。也有研究证实小胶质细胞在神经病理性疼痛的形成中有重要的作用。既往研究还发现正常小鼠鞘内给注射MCP-1能激活CCR2活化脊髓小胶质细胞,并能诱发机械痛敏且成剂量依赖性,但预先鞘内注射MCP-I的中和抗体就能阻止小胶质细胞的激活并且预防机械性痛敏的发生。此外,免疫荧光双标发现脊髓小胶质细胞OX-42和CCR2共表达,鞘内注射MCP-1中和抗体能够抑制神经病理性疼痛模型中脊髓背角小胶质细胞的激活和有效缓、解神经病理性疼痛。炎性细胞因子在慢性痛的调控中具有重要作用。IL-1、IL-6不但在神经-内分泌免疫功能系统中发挥重要作用,也是急性炎性反应的敏感指标,伤害性刺激可引起IL-1、IL-6水平升高,其升高的程度与疼痛关系密切。TNF-a可通过激活环氧化酶-2诱导前列腺素E的合成导致痛觉过敏,也可通过诱发缓激肽、P物质、儿茶酚胺的释放导致痛觉过敏。通过激活神经元和胶质细胞上的TNF-a、IL-1和IL-6受体可致神经兴奋性提高,从而导致中枢敏化和痛觉敏感性增加。然而,骨癌痛吗啡耐受大鼠中MCP-1是否参与吗啡耐受的产生,是否通过CCR2激活小胶质细胞释放炎症细胞因子,从而导致吗啡耐受呢?这正是本课题要研究的问题。第一部分:MCP-1在骨癌痛吗啡耐受大鼠中的作用目的观察骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓MCP-1、CCR2的表达情况。研究鞘内注射MCP-1中和抗体后骨癌痛吗啡耐受大鼠疼痛行为学指标机械缩足阈值(PWT paw withdrawal threshold)和热缩足潜伏期(PWLpaw withdrawal latency)的变化。方法成年雌性SD大鼠,体重150～170g,24只大鼠,随机分为4组(n=6):对照组(S组)、吗啡耐受组(M组)、骨癌痛组(B组)、骨癌痛吗啡耐受组(BM组)。S组大鼠胫骨髓腔注射NS5μ1,第9天鞘内注射NS4W,2次/d,连续9d;M组大鼠胫骨髓腔注射NS5μl,第9天鞘内注射20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d;B组胫骨髓腔注入Walker 256细胞5μl(2×1 07个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d;BM组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker 256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d。于术后18d处死各组大鼠,取L4-5脊髓组织,采用Western-blot法检测大鼠脊髓MCP-]表达情况,采用RT-PCR法测定大鼠脊髓MCP-1、CCR2表达情况。成年雌性SD大鼠48只,随机分为6组(n=8):骨癌痛组(B组)、骨癌痛吗啡耐受组(BM组)、骨癌痛吗啡耐受注射中和抗体组(BM+Ab组)、骨癌痛吗啡耐受注射IgG组(BM+IgG组)、骨癌痛注射中和抗体组(B+Ab组)、骨癌痛注射IgG组(B+IgG组)。B组大鼠胫骨髓腔注入Walker2 5 6细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d;BM组大鼠胫骨骨髓腔注入Wa l k e r 2 5 6细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d;BM+Ab组大鼠胫骨骨髓腔注入Walk e r 2 5 6细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射MCP-1中和抗体10μg,连续3d;BM+IgG组大鼠胫骨骨髓腔注入Walk e r 256细胞5μl(2×1 07个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/k g吗啡,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射IgG10μg,连续3d;B+Ab组大鼠胫骨髓腔注入Wa l k e r 2 5 6细胞5μl(2×1 07个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射MCP-1中和抗体10μg,连续3d;B+IgG组大鼠胫骨骨髓腔注入Wa l k e r 256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射IgG10μg,连续3d。术前、术后3d、6d、9d、12d、15d、18d检测各组大鼠机械缩足阈值(PWT paw withdrawal threshold test)和热缩足阈值(TWL thermal withdrawal latency)。结果M组大鼠较S组、M组和B组大鼠脊髓MCP-1、CCR2表达明显增多(P<0.05)。BM+Ab组大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体后机械缩足阈值(PWT paw withdrawal threshold test)和热缩足阈值(TWL thermal withdrawal latency)明显升高(P<0.05)。结论MCP-1可能在骨癌痛吗啡耐受中起重要作用。第二部分:鞘内注射MCP-1中和抗体对骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓OX-42和炎症因子TNFα、IL-1、IL-6表达的影响。目的研究鞘内注射MCP-1中和抗体后骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓OX-42和炎症因子TNFα、IL-1、lL-6表达的变化。方法成年雌性SD大鼠72只,随机分为6组(n=12):骨癌痛组(B组)、骨癌痛吗啡耐受组(BM组)、骨癌痛吗啡耐受注射中和抗体组(BM+Ab组)、骨癌痛吗啡耐受注射IgG组(BM+IgG组)、骨癌痛注射中和抗体组(B+Ab组)、骨癌痛注射IgG组(B+IgG组)。B组大鼠胫骨髓腔注入Wa l k e r 2 5 6细胞5μl(2× 107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d;BM组大鼠胫骨骨髓腔注入Walk e r 2 5 6细胞5μl(2× 1 07个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d;BM+Ab组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker2 5 6细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射MCP-1中和抗体10μg,连续3d;BM+IgG组大鼠胫骨骨髓腔注入Wa 1 k e r256细胞5μl(2×1 07个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射IgG10μg,连续3d;B+Ab组大鼠胫骨髓腔注入Walker2 5 6细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射MCP-1中和抗体10μg,连续3d;B+IgG组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射IgG10μg,连续3d。术后18d处死全部大鼠,取L4-5脊髓组织,采用免疫组化法测定OX-42的表达情况,采用RT-PCR法检测炎症因了 TNFα、IL-1、IL-6的表达情况。结果BM+Ab组大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体后脊髓OX-42和炎症因子TNFα、IL-1、IL-6表达明显减少(P<0.05)。结论MCP-1可能通过激活小胶质细胞引发炎症反应从而导致骨癌通吗啡耐受。