侵袭性真菌感染是免疫力低下病人不得不面临的严峻挑战。近些年,肿瘤,艾滋病,器官移植等免疫低下病人的侵袭性真菌感染率不断上升,且死亡率极高。临床上侵袭性真菌感染的常见病原多为念珠菌属,但隐球菌尤其是新生隐球菌,丝状真菌尤其是曲霉菌属等条件致病性真菌感染的发生近年来也呈逐年上升趋势。对于这些感染的临床治疗而言,治疗效果很大程度上取决于病人的免疫力状况及能否及时给与准确有效的抗真菌药物。目前临床上常用的抗真菌药物主要有两性霉素B,酮康唑,氟康唑,泊沙康唑、卡泊芬净等。有文献报道,临床上分离到越来越多的对唑类抗真菌药物和两性霉素B耐药的曲霉菌株,因此有必要研究一种能够快速检测鉴定临床常见曲霉菌的方法,为临床进行更有效的侵袭性曲霉菌感染治疗提供参考。高分辨熔解曲线分析技术的基本原理是在PCR完成后,升高PCR体系温度,利用双链DNA饱和荧光染料,实时监测升温过程中双链DNA饱和荧光染料与体系中DNA双链的结合情况(仪器上反映为荧光信号的变化),达到DNA双链序列分析的目的。双链DNA饱和荧光染料的结合原理与传统的荧光定量PCR染料不同。传统的荧光染料如Sybr Green等属于不饱和荧光染料,体系中此种荧光染料存在对PCR反应有抑制作用,因此在体系中加入的不饱和荧光染料浓度很低,远远低于产物DNA双链结构中染料结合位点的数目,DNA双链结构中存在大量的空余荧光染料结合位点。PCR过程完成产生大量的产物DNA双链,荧光染料分子结合在产物DNA双链上的染料结合位点。随着体系温度逐渐升高,体系中的DNA双链开始变性解链,荧光染料分子逐渐离开DNA双链结合位点,反映为荧光信号的逐渐降低。Sybr Green等不饱和荧光染料分子在离开DNA双链的过程中会发生分子结合位置的重排,因DNA解链而离开的不饱和荧光染料分子会迅速重新结合到尚未解链的其他双链部分上空余染料结合位点,荧光信号的变化失真,不能准确反映体系内DNA双链的解链情况。而饱和荧光染料如LC Green等对PCR反应基本无抑制作用,PCR体系中荧光染料的添加量远远高于体系中DNA双链上的染料结合位点数目,DNA双链上不会存在空余的染料结合位点,解链过程中能够最大程度上减少染料分子重排。体系温度升高,体系中DNA双链变性解链,饱和荧光染料分子与解链的DNA双链解离,因其他尚未解链的DNA双链上不存在空余结合位点,解离的染料分子不会重新结合到双链DNA上,荧光信号的变化能够真实反映体系中双链DNA的解链情况,使利用熔解曲线进行序列分析成为可能。不对称PCR扩增技术(asymmetric PCR)顾名思义,不对称PCR方法中两种引物的量相差悬殊,通常1：5-1：100不等,其中量相对较少的引物称为限制引物,相对过量的引物称为过剩引物。不对称PCR体系在反应的前几十个循环中同时存在正向引物和反向引物,可以生成一定数量的双链产物,经过15-30个循环左右,浓度相对较低的限制引物消耗完全。在PCR反应的后面几十个循环中,体系中仅存在过剩引物。过剩引物在体系中扩增产生大量的单链DNA。在高分辨熔解曲线的基本分析原理和不对称PCR扩增技术的基础上,引入非标记探针技术,是对高分辨熔解曲线技术的一种延伸和应用。非标记探针是长度在20-40bp左右的3’端封闭阻止延伸的一段寡核苷酸链。与传统的荧光探针相比,非标记探针寡核苷酸链只需要在探针的3’端进行封闭阻止其在PCR过程中发生自身扩增,而无需任何荧光基团修饰。在PCR反应完成后,进行一个变性,复性的基本过程,探针结合到单链产物上,形成局部双链结构。再进行升温变性,采集荧光信号,在相对较低的温度时,探针与产物结合形成的局部双链结构发生解链,反映为荧光信号降低,产生探针熔解峰。继续升温,PCR体系中产生的目的DNA产物发生熔解解链,荧光信号降低明显,产生产物熔解峰。通过分析探针峰和产物熔解峰的熔解温度(melting temperature, Tm),使序列分析更加敏感,特异。在本研究中,我们将高分辨熔解曲线分析技术,非标记探针技术和不对称PCR技术引入四种临床常见曲霉菌的检测鉴定中,试图探索一种快速,准确,经济的曲霉菌病原检测鉴定方法。第一部分“高分辨熔解曲线分析通用真菌引物扩增片段检测鉴定四种常见曲霉菌”研究方法查找GeneBank中公布的隐球菌属,念珠菌属,曲霉菌属,青霉属等多种临床常见真菌及人类的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITS1、2基因序列。通过Clustal X软件比对找出与人类无序列同源性的真菌保守区段。以真菌核糖体RNA基因中的内转录间隔区2(ITS2)为靶基因,在5.8S和28S核糖体RNA基因上设计真菌通用引物,在BLAST中比对其特异性。利用设计的真菌通用引物扩增四种曲霉菌的ITS2段,将扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。选择烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉ATCC标准菌株、临床常见多种细菌和人DNA进行引物特异性检测。选择对荧光定量PCR和高分辨熔解曲线分析有较大影响的因素,如退火温度,引物浓度,Mg2+浓度等进行体系的优化。以烟曲霉ITS2PCR合成产物构建载体克隆进行灵敏度检测。将构建成功的质粒,按照1：10倍比稀释,稀释9个浓度梯度,在各浓度取1ul进行荧光定量PCR扩增。实验结果1、设计的引物序列PrimerF-AGCGAAATGCGATAASTARTGTG, PrimerR-TCCTCCGCTTATTGATATGC,扩增片段长度335bp。2、引物特异性检测结果可见只有相应的四种曲霉菌有扩增条带,细菌及人DNA均未扩增。3、该方法的检测限可达10copies/ul.4、高分辨熔解曲线分析结果显示,烟曲霉,黄曲霉,土曲霉,黑曲霉四种曲霉菌的熔解曲线形状和Tm值差异较大。结论此部分的研究证实,四种曲霉菌的ITS2段靶基因熔解曲线差异大,通过这种方法不需测序可以将四种曲霉菌鉴别出来。若将此方法扩展至其他临床病原真菌,建立临床病原真菌的熔解曲线标准库。只需要基本的PCR引物,待测菌株DNA模板,LC Green饱和荧光染料,和能够进行高分辨熔解曲线分析的仪器,在熔解曲线分析完成后,将待测菌株扩增产物的熔解曲线与熔解曲线标准库中的曲线进行比对,在一定程度上能够将熔解曲线标准库中已存在熔解曲线比对标准的临床病原真菌待测菌株快速检测鉴定出来,具有省时、省力、省钱的特点。第二部分“四种特异性非标记探针结合高分辨熔解曲线检测鉴定四种常见曲霉菌”研究方法根据核糖体RNA基因的内转录间隔区2可变区序列设计四种曲霉菌的种特异性探针,并将探针的3,端进行C6氨基化修饰封闭以阻止在体系中DNA聚合酶的作用下探针自身扩增延伸。在Oligo6.0和Primer Express3.0软件中评价引物与探针,在BLAST中比对探针与引物的特异性。利用第一部分中设计的通用真菌引物进行不对称PCR。PCR完成后,加入四种曲霉菌特异性非标记探针,再经过变性复性,使探针与产物单链形成局部双链结构,进行熔解曲线分析.选择对不对称PCR体系有较大影响的退火温度,引物浓度,引物比例,Mg2+浓度,探针浓度等因素优化体系。退火温度由50℃递增至65℃,引物浓度由0.1μmol/L逐渐递增至0.5μmol/L,上下游引物比例由1：2递增至1：20及2：1递增至20：1,探针浓度由0.05μmol/L递增至0.5μmol/L,Mg2+浓度由0.5mmol/L递增至5mmol/L进行体系优化。实验结果1、优化后最终的体系组成和反应条件为：5×PrimeSTAR Buffer,4μl；Mg2+lmmol/L, dNTP Mixture(各2.5mmol/L),1.6μl；引物F,0.25μmol/L;引物R,0.05μmol/L; PrimeSTAR HS DNA Polymerase,0.2μl；LC Green染料,1μl；四种探针各0.25μmol/L。模板,1μl；及去离子水,体系总体积20μl。PCR条件：98℃,10s;60℃,10s；72℃,18s；循环数60,PCR扩增完成后进行一个变性复性的过程以促进探针与产物单链的结合。98℃,60s,40℃,30s。经过变性复性过程使3’端封闭的探针与产物单链结合后,设置熔解起始温度为55℃,结束温度为98℃,保持温度为53℃。2、四种曲霉菌模板相应的非标记探针熔解曲线分析都出现了两座熔解峰。根据第一部分中四种曲霉菌真菌通用引物扩增片段高分辨熔解曲线分析结果可知,ITS2扩增产物片段的Tm值介于90℃-95℃之间,故Tm值介于90℃-95℃之间的熔解峰使不对称PCR扩增的前几十个循环产生的双链产物的熔解峰,即产物峰。根据软件评估可知,探针的Tm值高于75℃。故图中Tm值介于82°C-87℃之间的熔解峰为非标记探针与不对称PCR扩增的后几十个循环,浓度相对较低的下游引物耗尽时,由浓度相对较高的上游引物扩增得到的单链产物结合形成的局部双链结构的熔解峰,即探针熔解峰。探针峰与产物峰之间的Tm值差异明显。讨论由于核糖体RNA基因的内转录间隔区2同时包含着可变区和中度保守区序列。根据GeneBank中已公布的烟曲霉,黄曲霉,土曲霉,黑曲霉菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2序列发现,内转录间隔区2的可变区中不仅存在着种间差异,也存在着种内序列差异,长度由1-3bp不等。饱和荧光染料高分辨熔解曲线可检测出低至1bp的碱基差异。由于种内序列差异的存在,使得高分辨熔解曲线的形状和Tm值可能发生变形和移动,给鉴定带来一定的困难。我们根据四种曲霉菌的核糖体RNA基因的可变区ITS2区序列,设计了具有曲霉菌种特异性的探针,并将探针的3’端进行C6氨基修饰阻止探针与模板结合后发生延伸。加入不同浓度的上下游引物,进行不对称PCR。不对称PCR完成后,体系中存在两种PCR产物,一种是在PCR过程的前几十个循环产生的正常的双链目的产物,一种则是在浓度相对较低的引物消耗完全后,由浓度相对较高的引物在PCR过程的后几十个循环产生的大量单链产物。经过变性复性过程,探针与PCR过程的后几十个循环产生的大量产物单链结合形成局部双链结构,探针-产物单链形成的双链结构经过升温变性产生探针峰,而由PCR过程的前几十个循环产生的双链产物在升温变性过程中产生产物峰,通过分析探针峰和产物峰的峰形和Tm值,达到检测鉴定四种曲霉菌的目的。利用曲霉菌的种特异性探针,分析探针与单链产物形成的双链结构熔解产生的探针峰,使我们不需要建立曲霉菌熔解曲线标准库就可以鉴定出曲霉菌的种属。更重要的是,引入非标记探针,能够克服曲霉菌的核糖体RNA基因的内转录间隔区2可变区种内序列差异可能造成的产物熔解曲线的变形和偏移,大大的提高了实用性和准确性。通过对探针的3’端进行封闭,而不需要对探针进行荧光基团标记,可大大的节约成本。