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背景： 内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是一种因缺血、缺氧等内质网理化环境改变和内质网过负荷等因素触发的高度保守的细胞应激性反应。适度的ERS可通过未折叠蛋白反应(Unfolded-Protein Response,UPR)机制恢复细胞自稳态和修复损伤。但持续或过度的ERS通过激活ER相关凋亡途径诱导细胞损伤和凋亡。钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网主要的钙结合蛋白,具有分子伴侣、调控细胞内钙稳态、蛋白质合成和修饰等多种功能,参与生物体内多种生理和病理过程。细胞发生ERS时,CRT表达升高,可作为ERS标志性分子之一。本课题组前期研究发现CRT影响基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)mRNA表达及酶的活性。近年来多项研究表明ERS在心肌缺血再灌注损伤、急性心肌梗死、冠心病不稳定斑块的形成以及心力衰竭的发生、发展等多种心血管疾病中起着重要的作用。ERS导致的相关细胞凋亡所参与的心肌细胞丢失,是影响缺血性心肌病心室重构的重要因素,但关于ERS能否影响细胞外基质成份的调节从而参与心室重构,尚需进一步深入研究。 目的： 本实验第一部分拟用H2O2处理H9C2心肌细胞,诱导ERS,进一步研究MMP-2和MMP-9活性的变化。第二部分利用了钙网蛋白基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(crt-/-)和野生型小鼠胚胎成纤维细胞(wt)为研究对象,探讨CRT基因的缺失对JNK活性的影响及JNK与p53的关系,以进一步揭示ERS相关性蛋白CRT调节细胞外基质成份的分子机制。 方法： 1.不同浓度的H2O2处理H9C2心肌细胞,MTT法检测其对细胞活性的影响,检测CRT、GRP78两种内质网应激性相关蛋白的表达,并收集培养基用明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9的酶活性。 2.体外培养wt和crt-/-小鼠胚胎成纤维细胞,提取总蛋白,用JNK特异性抗体从总蛋白中亲和分离出JNK蛋白,加入ATP和JNK特异性底物c-Jun进行细胞外磷酸化反应。用Western blot检测反应产物中c-Jun的磷酸化水平,以此来反映细胞内JNK的活性。 3.在wt细胞及crt-/-细胞加入不同浓度JNK抑制剂SP600125(0,20,30umol/l)处理24h,检测p53蛋白的表达;并用不同浓度p53抑制剂PFT-α(0,50,80umol/l)作用wt细胞及crt-/-细胞24h,检测JNK蛋白的表达。 结果： 1.MTT结果显示H9C2心肌细胞在H2O2(0～700umol/l)作用2h,其细胞活性与对照组相比未见明显变化。当H2O2浓度高达1000umol/l时对H9C2细胞活性有显著抑制作用(p<0.05)。 2.与对照组相比,不同浓度H2O2处理H9C2心肌细胞2h并未引起CRT表达的改变。H2O2处理H9C2心肌细胞4h引起CRT表达增高,p<0.05,并且使其MMP-2活性升高,MMP-9活性下降,但未引起GRP78的改变。 3.细胞外测定JNK活性提示wt细胞株c-Jun的磷酸化水平与crt-/-细胞株比较无明显差别。 4.给予不同浓度JNK抑制剂,无论是wt细胞还是crt-/-细胞,各处理组的p53均无明显变化;给予不同浓度p53抑制剂后,在wt株细胞中,JNK表达明显降低(p<0.05),并呈剂量依赖性。然而即使是在PFT-α80umol/l大剂量浓度作用下,wt细胞中JNK表达仍明显高于crt-/-细胞中JNK蛋白含量(p<0.05)。而各浓度组PFT-α对crt-/-细胞中的JNK表达无影响。 结论： 1.H2O2处理4小时,能引起ERS,但可能由于作用时间和浓度不够,导致ERS其他相关蛋白GRP78未检测到明显变化;并且H2O2处理4小时,H9C2心肌细胞MMP-2、MMP-9的活性发生了改变,但需要通过调整H2O2的作用时间和剂量来进一步确认。 2.在wt和crt-/-细胞中,JNK活性没有明显差异。 3.在wt和crt-/-细胞中,JNK信号通路可能不参与调节p53的表达,而p53对JNK可能起着正反馈调节作用。