论文部分内容阅读
背景与目的:肺癌是世界范围内最常见的癌症,其中非小细胞肺癌(NSCLC)几乎占85%以上。LHX2属于LIM蛋白家族,现已有研究发现,LHX2能够促进肿瘤的发生发展,但具有的作用机制还不是很清楚。microRNA对基因表达的调节作用是通过与特定靶基因3’UTR种子序列的完全或不完全互补配来实现的。研究表明在癌症的发生和发展中检测到了microRNAs表达的改变。预测显示多个microRNAs可以靶向LHX2的3’UTR区域。本研究旨在探讨NSCLC中LHX2表达的microRNA调控机制,为NSCLC的早期诊断和治疗提供确凿的实验依据。方法:(1)Real-Time PCR和Western Blot方法分别检测在人正常支气管细胞HBE和4株NSCLC细胞中LHX2基因的mRNA和蛋白的表达水平以及50对NSCLC组织样本中LHX2基因的mRNA表达水平。(2)将si-LHX2-1和si-LHX2-2转染至NSCLC细胞株A549和LTEP-α-2中,通过CCK-8和细胞集落形成方法观察细胞的增殖情况,验证LHX2对细胞增殖的作用。(3)生物信息学软件预测分析能够靶向LHX2 3’UTR区域的microRNAs,我们筛选到miR-1238。首先运用双荧光素酶活性检测实验验证miR-1238是否与LHX2 3’UTR区域的种子序列直接结合,验证miR-1238对LHX2的靶向作用。然后合成miR-1238 mimics瞬时转染A549和LTEP-α-2细胞,检测转染前后LHX2 mRNA和蛋白表达变化,(4)Real-Time PCR方法分别检测在人正常支气管细胞HBE和4株NSCLC细胞以及50对NSCLC组织样本中miR-1238表达水平,并将其和LHX2的表达作回归分析,统计出NSCLC中LHX2和miR-1238表达的相关性。(5)将mi R-1238的模拟体mimics转染至NSCLC细胞株A549和LTEP-α-2中,通过CCK-8和细胞集落形成方法观察细胞的增殖情况。结果:(1)a、与HBE相比,LHX2 mRNA和蛋白在NSCLC细胞株A549、LTEP-a-2、H460和H1299中的表达均是上升的。b、在50例NSCLC组织样本中LHX2 mRNA表达上调(p<0.05)。综上所述,LHX2基因在NSCLC中的表达是上升的。(2)通过CCK-8和集落形成实验可知,干扰LHX2基因后,NSCLC细胞株的增殖是受到抑制的,因此,LHX2基因能够促进NSCLC细胞株生长。(3)Dual Luciferase Reporter Assay实验可知miR-1238可以结合在LHX2基因的3’UTR区。NSCLC细胞株A549和LTEP-α-2瞬时转染miR-1238模拟体mimics,LHX2基因的mRNA和蛋白表达都下降。因此miR-1238下调LHX2基因的mRNA和蛋白表达并且这种作用是通过mi R-1238与LHX2基因的3’UTR种子序列直接结合引起的。(4)与HBE相比,在NSCLC细胞株A549、LTEP-a-2、H1299和H460中miR-1238的表达是下调的。在49例NSCLC组织样本中miR-1238的表达也是下降的。也就是说,在NSCLC中miR-1238是低表达的。将其和LHX2的表达作回归分析发现NSCLC中两者的表达之间是负相关的。(5)通过CCK-8和集落形成实验可知,miR-1238抑制NSCLC细胞株的增殖。结论:NSCLC细胞中,miR-1238低表达,LHX2高表达,并且miR-1238能够直接靶向LHX2的3’UTR种子序列。在50对肺癌组织中,同样是miR-1238低表达和LHX2基因高表达,并且呈现负相关。对mi R-1238和LHX2基因功能分析可知,miR-1238能够抑制肿瘤的生长,LHX2促进肿瘤的生长,过表达miR-1238能够下调LHX2 m RNA和蛋白的表达量。因此,miR-1238可能是一种抑癌基因,在肺癌的发生发展中,通过抑制LHX2基因的表达来抑制肿瘤的生长。通过研究miR-1238对LHX2基因的抑制作用可能会有助于提高我们对NSCLC的致病机制的了解,进而对NSCLC的诊断和治疗提供可靠的理论基础。