目的:巴克斯霉属(Backusella)属于真菌门,接合菌亚门,接合菌纲,毛霉目,广泛分布于土壤、粪便及腐烂的动植物尸体上。一般为条件致病菌,当机体抵抗力下降时侵入,引起人体浅部或深部真菌病。卷曲巴克斯霉原变种是巴克斯霉属其中的一个变种,目前国内外尚无该菌引起人体感染的相关报道。本研究所用菌株是2009年从我院1例白血病患者的面部皮损中分离而来,最终经中国科学院微生物研究所的郑儒永院士鉴定为卷曲巴克斯霉原变种(Backusella circina var.circina)(已测出基因序列)。本实验一方面通过对卷曲巴克斯霉原变种进一步的形态学观察,为实验室鉴定该菌提供依据;另一方面通过动物实验检测其是否可以引起系统性感染,并观察不同免疫状态和接种途径小鼠的一般状况及死亡情况,同时通过对小鼠进行解剖、组织真菌逆培养、组织病理学检查等方法观察各脏器的感染情况,进一步了解此菌的致病力、脏器播散情况及组织病理学特点,为临床上诊断和治疗卷曲巴克斯霉原变种感染提供实验室依据。方法:1菌落形态学观察1.1菌落大体形态学观察:常温下复苏保存菌株,3天后转种于沙堡氏琼脂培养基(SDA)平皿上,分别于27℃和37℃的温箱内培养,每天观察并记录菌落生长情况。1.2小培养(方块法):挑取菌落点种于SDA小培养基上,分别置于27℃和37℃的温箱内,每天观察菌丝生长及孢子产生的情况。1.3光镜观察:每天挑取两个温度下的菌落置于载玻片上,滴加酚棉兰溶液,加盖盖玻片,光镜下观察。2动物致病性试验2.1卷曲巴克斯霉原变种系统性感染动物模型的制作:常温下复苏保存菌株,转种于SDA培养基上,置于27℃温箱培养3天。挑取菌株加入无菌生理盐水制成菌悬液,通过皮下、腹腔两种途径分别接种至免疫状态不同的小鼠。2.2小鼠活动情况及死亡率的观察:观察并记录各组小鼠感染后的一般状况以及4周内的自然死亡日期和数量。2.3内脏的大体形态观察:随机抽取不同感染阶段的小鼠处死解剖,分离出心、肝、脾、肺、肾各脏器,并观察有无肿大或萎缩、有无颜色变化等大体形态改变。2.4组织真菌逆培养:将小鼠各脏器在无菌条件下研磨至匀浆状,3点接种至SDA试管培养基斜面上,每个脏器移种2管,27℃下培养3天,观察生长菌落的大体形态及制成湿片后的光镜下形态。2.5组织病理学检查:将脏器用10℅福尔马林浸泡固定,依次经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片,分别经过HE染色和PAS染色,光镜下观察各脏器有无组织病理学改变。结果:1 SDA培养基上的菌落直径:菌落在SDA培养基上27℃下较37℃生长快,第1天、3天、7天直径比较均有显著性差异(P<0.05)。2 SDA培养基上的菌落形态:接种8h后开始有菌落生长,形态大体为白色羊毛状。27℃下菌落生长速度快,气生菌丝稀疏、蓬松,向上生长趋势较为明显。37℃下菌落生长较慢,且菌落边缘不整齐。两种温度下培养基背面均呈白色,未见明显颜色变化。3光镜下形态:可见大量粗大、透明、多核、无分隔的菌丝,直径粗细不均匀,分枝比较明显,部分有侧生菌丝。菌丝顶端可见膨大的球形孢子囊,破裂后可释放出大量具有荧光、壁薄、圆形或椭圆形的孢子,破裂的孢子囊偶见囊领状结构。4小鼠感染后一般状况:不同免疫状态皮下组小鼠活动及进食量无明显改变,免疫抑制组较免疫正常组出现的接种部位局部损害严重,但均可自愈。腹腔接种组小鼠活动量及进食量减少,毛发倒逆无光,逐渐消瘦,有自然死亡情况,免疫抑制组的一般状况更差。5小鼠感染后自然死亡情况:免疫抑制腹腔组接种后第2天小鼠出现死亡,第5天达到死亡高峰,1周死亡率为56.7%,2周死亡率达96.7%;免疫正常腹腔组接种后第2天开始死亡,第9~10天达到死亡高峰,1周死亡率30%,2周死亡率80%,2周后无自然死亡。两组生存天数差异有显著性(P<0.05),免疫正常腹腔组较免疫抑制腹腔组的生存天数长。不同免疫状态皮下组均无自然死亡。6各脏器的大体改变:腹腔组自然死亡小鼠心肺充血、水肿,肝脾普遍可见不同程度肿大,呈紫红色,肾脏偶见呈紫红色充血水肿,部分小鼠肝﹑脾和肺表面可见针尖至粟粒大小白色化脓感染灶。皮下组各脏器未见明显大体改变。7组织真菌逆培养:皮下组中,免疫抑制小鼠皮肤组织生长出与接种菌株形态相同的菌落,免疫正常小鼠皮肤组织未见菌落生长,不同免疫状态小鼠的内脏组织逆培养均为阴性。腹腔组部分脏器逆培养有菌落生长,其菌落大体及镜下形态均与接种的菌株相同,免疫抑制和免疫正常两组真菌逆培养阳性率有显著性差异(P<0.05),免疫抑制小鼠脾脏、肺脏、肝脏阳性率明显高于心脏、肾脏(P<0.005)。8组织病理学变化:不同免疫状态皮下组小鼠的各内脏均无明显病理学变化。不同免疫状态的腹腔注射组,HE染色可见血栓形成和邻近组织变性、坏死,有大量炎细胞浸润,少量巨噬细胞增生。两种染色均可见坏死组织、血管内有大量紫红色的菌丝及孢子。结论:1卷曲巴克斯霉原变种只有一种菌落形态,在最适合其生长的SDA培养基上27℃下较37℃生长良好。2通过腹腔注射途径可以成功建立卷曲巴克斯霉原变种系统性感染小鼠模型;皮下注射接种不能导致小鼠系统性感染。3该菌属于条件致病菌,机体免疫力低下时更易引起感染,且感染也更加严重。但较大菌量也可导致正常免疫小鼠系统性感染,说明该菌致病力及侵袭性强。4卷曲巴克斯霉原变种引起的特征性组织病理学改变为极易侵犯血管导致血栓形成和组织坏死,伴有各种炎细胞浸润。5无论何种免疫状态,肝、脾、肺均为该菌最易感染的器官;而心、肾较不易感染。