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内膜增生是各种血管疾病的主要病理过程，涉及血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs )以及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)等血管细胞异常的增殖、迁移以及细胞基质成分的异常。VSMCs具有表型重塑的潜能，生理情况下VSMCs表现为收缩表型，增殖、迁移、合成能力均较低下，但在病理条件下VSMCs可以发生去分化，出现异常的增殖、迁移、凋亡以及合成，即表现为促炎、促动脉粥样硬化表型，参与内膜增生、血管重构等病理过程。血流动力学环境异常是导致VSMCs表型转变、出现异常生物学行为改变的重要因素。机体内血管壁承受的血流动力学环境刺激可以分解为三个部分，壁剪切力(wall shear stress,WSS )、环形扩张力(circumferential stretch or cyclic strain，CS)以及透壁压力(transmural pressure，TP)或称静水压力(hydrostatic pressure，HP)。大量的研究阐述了WSS和CS对VECs和VSMCs的作用及机制，而关于TP对VSMCs或VECs的作用及机制研究相对匮乏。活性氧(reactive oxygen species，ROS)代谢是近年来的研究热点，NADPH氧化酶(NADPH oxidase ,NOX)家族是血管系统中ROS的主要来源，NOX来源的ROS(NOX-ROS)在血管系统氧化还原性信号瀑布中发挥着重要的调控作用。NOX家族中一共有7个亚型(NOX1-5以及Duorx1-2)，其中普遍在人和动物血管细胞中表达的为NOX1、NOX2、NOX4和NOX5，而NOX5主要在灵长动物中表达。大量研究表明NOX-ROS在VECs和VSMCs血流动力学机械传导中发挥着重要的调控作用，但NOX各个不同亚型以及各亚型不同的亚细胞分布和亚细胞定位均发挥着不同的作用，其具体机制仍无法完全阐明。生存素(survivin,SVV)属于凋亡抑制蛋白家族，能够对细胞增殖、迁移、凋亡等多方面进行调节，早期在肿瘤研究中备受关注，近年来研究发现SVV参与了多种血管损伤性反应，可能在VSMCs表型转变及内膜增生调控中发挥着重要的作用。本研究目的在于探索TP对内膜增生中VSMCs增殖和迁移的作用，以及NOX-ROS、SVV在其中的调控作用。
第一部分兔颈总动脉腔内高压促进内膜增生
目的：采用动脉缩窄术构建兔颈总动脉(common carotid artery,CCA)腔内高压模型体内模拟高TP环境，观察腔内高压致内膜增生的作用及初步探讨相关机制。
方法：新西兰兔术前1周开始高脂饲料喂养，设立对照组、假手术组和缩窄组，缩窄组结扎兔左侧CCA后，缩窄右侧CCA约50%左右，构建缩窄近心端腔内高压模型，距缩窄处近心1cm以内血管段定义为缩窄近心端血管段，距缩窄处远心1cm以内血管段定义为缩窄远心端血管段。于术后即刻、1周、1月和2月行右侧CCA置管测压验证模型，同时获取右侧CCA血管标本。采用HE染色观察血管壁病理组织学改变，采用Masson三色染色以及免疫组化检测VSMCs标记物α-SMA观察血管壁成分改变，采用ROS探针检测血管壁组织ROS水平，采用免疫组化检测NOX1、2、4和SVV的蛋白表达水平。
结果：CCA插管测压结果显示相较于对照组术后2月内缩窄近心端血管腔内血压均能保持较高水平(p＜0.05)，模型构建成功。HE染色结果显示腔内压较高的缩窄近心端血管段内膜增生明显，而同一体内缩窄远心端血管段、对照组以及假手术组未见内膜增生。Masson三色染色以及免疫组化检测α-SMA表达提示大量增生的VSMCs以及肌纤维是构成增生内膜的主要成分。检测组织ROS水平结果显示腔内压较高的缩窄近心端组织ROS明显高于同一体内缩窄远心端血管段、对照组以及假手术组(p＜0.05)。免疫组化检测NOX1、2、4和SVV的蛋白表达水平结果显示在腔内压较高的缩窄近心端血管段中NOX1、2以及SVV蛋白表达水平明显高于同一体内缩窄远心端血管段、对照组以及假手术组(p＜0.05)，NOX4表达水平各组无明显差异。
结论：新西兰兔CCA腔内高压，即高TP环境，能够促进内膜增生，VSMCs是增生内膜中重要的细胞成分；NOX-ROS和SVV可能共同参与了腔内高压促进内膜增生的病理过程。
第二部分TP促进HASMCs增殖和迁移
目的：以动物实验为基础，明确TP对人动脉血管平滑肌细胞(human arterial vascular smooth muscle cells,HASMCs)增殖和迁移的影响。
方法：体外培养HASMCs，采用特制细胞加压培养仓体外模拟静态TP，分别在100mmHg、120mmHg、140mmHg、160mmHg、180mmHg、200mmHg压力下培养细胞6h，以未施加压力培养的细胞作为对照组，采用CCK-8试验、流式细胞术分析细胞周期、划痕实验、Transwell迁移实验以及检测相关指标的表达等方法观察不同TP环境下HASMCs增殖和迁移的变化。
结果：CCK-8试验结果提示当TP超过160mmHg时细胞活力及增殖较对照组明显增强(p＜0.05)，160mmHg及以上三组(后文中称高压力组)间无明显差异。流式细胞术分析细胞周期发现TP超过160mmHg时与对照组相比明显促进了细胞周期(p＜0.05)，G0/G1期细胞比例降低，S期和G2/M期细胞比例升高，高压力组间无明显差异。细胞免疫荧光(Immunofluorescence，IF)和蛋白印迹(Western blot， WB )检测增殖标志物增殖细胞核抗原(proliferating cellular nuclear antigen,PCNA)以及WB检测周期蛋白(CyclinD1、CyclinE、CyclinB1、CDK4、CDK2和CDC2)表达结果发现与对照组相比TP超过160mmHg时明显上调了PCNA和周期蛋白的表达(p＜0.05)，高压力组间无明显差异。划痕实验和Traswell迁移实验结果均发现TP超过160mmHg时，HASMCs迁移能力较对照组显著增加(p＜0.05)，而高压力组间无明显差异。同时WB结果显示与对照组相比TP超过160mmHg时显著上调了基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)(MMP2、MMP7、MMP8、MMP9)的表达(p＜0.05)。
结论：TP能够促进HASMCs增殖和迁移，表现为当TP低于或超过160mmHg时，其促进作用分别呈现出“关闭”和“开启”的模式。
第三部分NOX-ROS在TP促进HASMCs增殖和迁移中的作用
目的：明确NOX-ROS在TP促进HASMCs增殖和迁移中的作用。
方法：首先采用ROS检测试剂盒检测不同梯度TP环境下HASMCs中ROS水平。q-PCR和WB检测不同梯度TP环境下HASMCs中NOX家族亚型NOX1、NOX2、NOX4和NOX5mRNA和蛋白相对表达水平。然后在具有明显增殖和迁移促进作用的180mmHg压力环境下分别添加ROS清除剂N-乙酰半胱氨(N-acetyl-L-cysteine，NAC)(1mM)和选择性NOX抑制剂罗布麻宁(apocynin，Apo)(100uM)两种药物共处理HASMCs6h，检测细胞ROS水平以及细胞增殖和迁移能力变化。
结果：当压力超过160mmHg时，HASMCs中ROS水平较对照组明显升高(p＜0.05)，NOX2转录和蛋白表达水平明显增加(p＜0.05)，高压力组间ROS水平和NOX2的表达无明显差异，各组间NOX1、NOX4和NOX5表达均无明显差异。选择性抑制剂Apo抑制NOX2明显减弱了HASMCs中TP诱导的ROS生成(p＜0.05)。CCK-8试验结果提示NAC和Apo明显减弱了TP对细胞活性及增殖的促进作用(p＜0.05)；流式细胞术分析发现NAC和Apo明显减弱了TP对细胞周期的促进作用(p＜0.05)；划痕实验和Traswell迁移实验结果均发现NAC和Apo明显减弱了TP对细胞迁移的促进作用(p＜0.05)；IF和WB结果发现NAC和Apo明显减弱了TP诱导的PCNA、周期蛋白(CyclinD1、CyclinE、CyclinB1、CDK4、CDK2和CDC2)以及MMPs(MMP2、MMP7、MMP8、MMP9)表达(p＜0.05)。
结论：TP主要通过NOX-ROS相关的途径促进HASMCs增殖和迁移，亚型NOX2在其中发挥主要作用，通过NAC清除ROS或Apo抑制NOX2能够显著减弱TP对HASMCs增殖和迁移的促进作用。
第四部分SVV在TP促进HASMCs增殖和迁移中的作用
目的：明确SVV在TP促进HASMCs增殖和迁移中的作用以及与NOX-ROS间的作用。
方法：采用q-PCR和WB分别检测不同梯度TP环境下，100nM外源性H2O2(模拟高ROS水平环境)环境下，以及ROS清除剂NAC、选择性NOX抑制剂Apo分别与TP(180mmHg)共培养环境下SVV转录及蛋白表达水平。构建SVV(BIRC5)过表达和siRNA慢病毒载体，通过MOI梯度转染HASMCs，摸索最适MOI，并通过q-PCR和WB从核酸及蛋白水平验证SVV上调和下调效率。检测慢病毒干预后细胞增殖及迁移能力变化以及对TP(180mmHg)诱导细胞增殖和迁移的影响。检测慢病毒干预下细胞ROS水平以及NOX家族亚型NOX1、NOX2、NOX4和NOX5转录和蛋白表达的变化。
结果：在TP超过160mmHg以及100nM外源性H2O2环境下SVV的转录以及蛋白表达水平较对照组明显提高(p＜0.05)；NAC清除ROS、Apo选择性抑制NOX2能够明显抑制TP诱导的SVV表达(p＜0.05)。慢病毒LV-BIRC5在MOI=10、48h条件下转录效率较佳，q-PCR及WB结果显示转染LV-BIRC5能够明显上调SVV的转录和蛋白表达；慢病毒LV-BIRC5-RNAi在MOI=20、48h条件下转录效率较佳，q-PCR及WB结果显示转染LV-BIRC5-RNAi能够明显下调SVV的转录和蛋白表达。CCK-8试验及流式周期分析结果提示上调SVV能够明显促进HASMCs细胞增殖及细胞周期(p＜0.05)，下调SVV明显抑制细胞增殖及阻滞细胞周期(p＜0.05)；划痕实验和Traswell迁移实验结果均发现上调SVV能够明显促进HASMCs细胞迁移(p＜0.05)，下调SVV明显抑制细胞迁移(p＜0.05)；IF和WB结果显示上调SVV能够明显促进PCNA、周期蛋白(CyclinD1、CyclinE、CyclinB1、CDK4、CDK2和CDC2)以及MMPs(MMP2、MMP7、MMP8、MMP9)的表达(p＜0.05)，下调SVV明显抑制PCNA、周期蛋白以及MMPs表达(p＜0.05)。下调SVV表达能够明显抑制TP(180mmHg)对细胞活性和增殖的增强作用以及对细胞周期和迁移的促进作用，明显抑制TP诱导的PCNA、周期蛋白以及MMPs表达(p＜0.05)。上调SVV表达能够明显提高细胞基础ROS水平、NOX2基础转录以及蛋白表达水平(p＜0.05)，下调SVV表达能够显著抑制TP诱导的ROS产生和NOX2表达(p＜0.05)，同时明显降低NOX4的基础表达水平(p＜0.05)。
结论：TP诱导的SVV表达是通过NOX-ROS相关的途径调控的，SVV能够调控HASMCs增殖和迁移，在TP促HASMCs增殖和迁移调控中发挥着关键作用。同时SVV也能反馈调节NOX，其HASMCs增殖和迁移促进作用可能与亚型NOX2相关，维持基础细胞增殖及迁移作用可能与亚型NOX4相关。综上，课题组提出NOX-ROS/SVV轴是TP促进内膜增生中HASMCs增殖和迁移的重要调控途径。
第一部分兔颈总动脉腔内高压促进内膜增生
目的：采用动脉缩窄术构建兔颈总动脉(common carotid artery,CCA)腔内高压模型体内模拟高TP环境，观察腔内高压致内膜增生的作用及初步探讨相关机制。
方法：新西兰兔术前1周开始高脂饲料喂养，设立对照组、假手术组和缩窄组，缩窄组结扎兔左侧CCA后，缩窄右侧CCA约50%左右，构建缩窄近心端腔内高压模型，距缩窄处近心1cm以内血管段定义为缩窄近心端血管段，距缩窄处远心1cm以内血管段定义为缩窄远心端血管段。于术后即刻、1周、1月和2月行右侧CCA置管测压验证模型，同时获取右侧CCA血管标本。采用HE染色观察血管壁病理组织学改变，采用Masson三色染色以及免疫组化检测VSMCs标记物α-SMA观察血管壁成分改变，采用ROS探针检测血管壁组织ROS水平，采用免疫组化检测NOX1、2、4和SVV的蛋白表达水平。
结果：CCA插管测压结果显示相较于对照组术后2月内缩窄近心端血管腔内血压均能保持较高水平(p＜0.05)，模型构建成功。HE染色结果显示腔内压较高的缩窄近心端血管段内膜增生明显，而同一体内缩窄远心端血管段、对照组以及假手术组未见内膜增生。Masson三色染色以及免疫组化检测α-SMA表达提示大量增生的VSMCs以及肌纤维是构成增生内膜的主要成分。检测组织ROS水平结果显示腔内压较高的缩窄近心端组织ROS明显高于同一体内缩窄远心端血管段、对照组以及假手术组(p＜0.05)。免疫组化检测NOX1、2、4和SVV的蛋白表达水平结果显示在腔内压较高的缩窄近心端血管段中NOX1、2以及SVV蛋白表达水平明显高于同一体内缩窄远心端血管段、对照组以及假手术组(p＜0.05)，NOX4表达水平各组无明显差异。
结论：新西兰兔CCA腔内高压，即高TP环境，能够促进内膜增生，VSMCs是增生内膜中重要的细胞成分；NOX-ROS和SVV可能共同参与了腔内高压促进内膜增生的病理过程。
第二部分TP促进HASMCs增殖和迁移
目的：以动物实验为基础，明确TP对人动脉血管平滑肌细胞(human arterial vascular smooth muscle cells,HASMCs)增殖和迁移的影响。
方法：体外培养HASMCs，采用特制细胞加压培养仓体外模拟静态TP，分别在100mmHg、120mmHg、140mmHg、160mmHg、180mmHg、200mmHg压力下培养细胞6h，以未施加压力培养的细胞作为对照组，采用CCK-8试验、流式细胞术分析细胞周期、划痕实验、Transwell迁移实验以及检测相关指标的表达等方法观察不同TP环境下HASMCs增殖和迁移的变化。
结果：CCK-8试验结果提示当TP超过160mmHg时细胞活力及增殖较对照组明显增强(p＜0.05)，160mmHg及以上三组(后文中称高压力组)间无明显差异。流式细胞术分析细胞周期发现TP超过160mmHg时与对照组相比明显促进了细胞周期(p＜0.05)，G0/G1期细胞比例降低，S期和G2/M期细胞比例升高，高压力组间无明显差异。细胞免疫荧光(Immunofluorescence，IF)和蛋白印迹(Western blot， WB )检测增殖标志物增殖细胞核抗原(proliferating cellular nuclear antigen,PCNA)以及WB检测周期蛋白(CyclinD1、CyclinE、CyclinB1、CDK4、CDK2和CDC2)表达结果发现与对照组相比TP超过160mmHg时明显上调了PCNA和周期蛋白的表达(p＜0.05)，高压力组间无明显差异。划痕实验和Traswell迁移实验结果均发现TP超过160mmHg时，HASMCs迁移能力较对照组显著增加(p＜0.05)，而高压力组间无明显差异。同时WB结果显示与对照组相比TP超过160mmHg时显著上调了基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)(MMP2、MMP7、MMP8、MMP9)的表达(p＜0.05)。
结论：TP能够促进HASMCs增殖和迁移，表现为当TP低于或超过160mmHg时，其促进作用分别呈现出“关闭”和“开启”的模式。
第三部分NOX-ROS在TP促进HASMCs增殖和迁移中的作用
目的：明确NOX-ROS在TP促进HASMCs增殖和迁移中的作用。
方法：首先采用ROS检测试剂盒检测不同梯度TP环境下HASMCs中ROS水平。q-PCR和WB检测不同梯度TP环境下HASMCs中NOX家族亚型NOX1、NOX2、NOX4和NOX5mRNA和蛋白相对表达水平。然后在具有明显增殖和迁移促进作用的180mmHg压力环境下分别添加ROS清除剂N-乙酰半胱氨(N-acetyl-L-cysteine，NAC)(1mM)和选择性NOX抑制剂罗布麻宁(apocynin，Apo)(100uM)两种药物共处理HASMCs6h，检测细胞ROS水平以及细胞增殖和迁移能力变化。
结果：当压力超过160mmHg时，HASMCs中ROS水平较对照组明显升高(p＜0.05)，NOX2转录和蛋白表达水平明显增加(p＜0.05)，高压力组间ROS水平和NOX2的表达无明显差异，各组间NOX1、NOX4和NOX5表达均无明显差异。选择性抑制剂Apo抑制NOX2明显减弱了HASMCs中TP诱导的ROS生成(p＜0.05)。CCK-8试验结果提示NAC和Apo明显减弱了TP对细胞活性及增殖的促进作用(p＜0.05)；流式细胞术分析发现NAC和Apo明显减弱了TP对细胞周期的促进作用(p＜0.05)；划痕实验和Traswell迁移实验结果均发现NAC和Apo明显减弱了TP对细胞迁移的促进作用(p＜0.05)；IF和WB结果发现NAC和Apo明显减弱了TP诱导的PCNA、周期蛋白(CyclinD1、CyclinE、CyclinB1、CDK4、CDK2和CDC2)以及MMPs(MMP2、MMP7、MMP8、MMP9)表达(p＜0.05)。
结论：TP主要通过NOX-ROS相关的途径促进HASMCs增殖和迁移，亚型NOX2在其中发挥主要作用，通过NAC清除ROS或Apo抑制NOX2能够显著减弱TP对HASMCs增殖和迁移的促进作用。
第四部分SVV在TP促进HASMCs增殖和迁移中的作用
目的：明确SVV在TP促进HASMCs增殖和迁移中的作用以及与NOX-ROS间的作用。
方法：采用q-PCR和WB分别检测不同梯度TP环境下，100nM外源性H2O2(模拟高ROS水平环境)环境下，以及ROS清除剂NAC、选择性NOX抑制剂Apo分别与TP(180mmHg)共培养环境下SVV转录及蛋白表达水平。构建SVV(BIRC5)过表达和siRNA慢病毒载体，通过MOI梯度转染HASMCs，摸索最适MOI，并通过q-PCR和WB从核酸及蛋白水平验证SVV上调和下调效率。检测慢病毒干预后细胞增殖及迁移能力变化以及对TP(180mmHg)诱导细胞增殖和迁移的影响。检测慢病毒干预下细胞ROS水平以及NOX家族亚型NOX1、NOX2、NOX4和NOX5转录和蛋白表达的变化。
结果：在TP超过160mmHg以及100nM外源性H2O2环境下SVV的转录以及蛋白表达水平较对照组明显提高(p＜0.05)；NAC清除ROS、Apo选择性抑制NOX2能够明显抑制TP诱导的SVV表达(p＜0.05)。慢病毒LV-BIRC5在MOI=10、48h条件下转录效率较佳，q-PCR及WB结果显示转染LV-BIRC5能够明显上调SVV的转录和蛋白表达；慢病毒LV-BIRC5-RNAi在MOI=20、48h条件下转录效率较佳，q-PCR及WB结果显示转染LV-BIRC5-RNAi能够明显下调SVV的转录和蛋白表达。CCK-8试验及流式周期分析结果提示上调SVV能够明显促进HASMCs细胞增殖及细胞周期(p＜0.05)，下调SVV明显抑制细胞增殖及阻滞细胞周期(p＜0.05)；划痕实验和Traswell迁移实验结果均发现上调SVV能够明显促进HASMCs细胞迁移(p＜0.05)，下调SVV明显抑制细胞迁移(p＜0.05)；IF和WB结果显示上调SVV能够明显促进PCNA、周期蛋白(CyclinD1、CyclinE、CyclinB1、CDK4、CDK2和CDC2)以及MMPs(MMP2、MMP7、MMP8、MMP9)的表达(p＜0.05)，下调SVV明显抑制PCNA、周期蛋白以及MMPs表达(p＜0.05)。下调SVV表达能够明显抑制TP(180mmHg)对细胞活性和增殖的增强作用以及对细胞周期和迁移的促进作用，明显抑制TP诱导的PCNA、周期蛋白以及MMPs表达(p＜0.05)。上调SVV表达能够明显提高细胞基础ROS水平、NOX2基础转录以及蛋白表达水平(p＜0.05)，下调SVV表达能够显著抑制TP诱导的ROS产生和NOX2表达(p＜0.05)，同时明显降低NOX4的基础表达水平(p＜0.05)。
结论：TP诱导的SVV表达是通过NOX-ROS相关的途径调控的，SVV能够调控HASMCs增殖和迁移，在TP促HASMCs增殖和迁移调控中发挥着关键作用。同时SVV也能反馈调节NOX，其HASMCs增殖和迁移促进作用可能与亚型NOX2相关，维持基础细胞增殖及迁移作用可能与亚型NOX4相关。综上，课题组提出NOX-ROS/SVV轴是TP促进内膜增生中HASMCs增殖和迁移的重要调控途径。