论文部分内容阅读
研究目的:
硫氧还蛋白-2(Thioredoxin 2, TXN2)是定位于线粒体的内源性抗氧化酶。氧化应激(Oxidative stress, OS)与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)病理改变有关。本研究主要探讨TXN2与AD病理改变中β-淀粉样前体蛋白(Amyloid-βprecursorprotein,APP)淀粉样代谢途径之间的关系。
研究方法:
1.动物试验
试验动物采用表达瑞典APP和早老素1外显子9突变型(Expressing Swedish APP and presenilin1 delta exon 9 mutations, APPswe/PS1E9)小鼠作为AD模型,野生型(C57BL/6,Wild-type, WT)小鼠作为对照,检测两组在6月和12月龄同年龄小鼠的大脑皮质及海马TXN2蛋白表达差异。
2.细胞试验
免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测TXN2的细胞定位,并研究TXN2对细胞活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平影响。
将TXN2小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)或TXN2质粒,转染至人神经母细胞瘤细胞(Human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)和稳定表达人全长APP的HEK293细胞(HEK293 cells stably expressing human full-length APP, HEK/APP),使TXN2表达降低或过表达。采用免疫印迹试验(Western blot,WB)和逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测TXN2对淀粉样β前体蛋白(Amyloid-βprecursorprotein,APP)淀粉样代谢途径中代谢酶β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)及中间代谢产物影响。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测TXN2敲低或过表达对于APP代谢终末产物β-淀粉样蛋白(Amyloidbetapeptide,Aβ)表达影响。
使用p65siRNA抑制核因子-κB通路(NuclearfactorκB,NF-κB),探究NF-κB通路是否参与TXN2对BACE1的调节。
WB检测过表达或敲除TXN2后,细胞凋亡相关蛋白表达情况。
研究结果:
1.TXN2在12月龄AD模型小鼠大脑皮质及海马的蛋白表达较对照组明显降低。而6月龄小鼠中,两组TXN2蛋白表达无明显差别。
2.在SH-SY5Y细胞中,TXN2定位于细胞线粒体,并可降低细胞内ROS表达。
3.在SH-SY5Y细胞中,敲低TXN2可在转录水平增加BACE1表达,而过表达TXN2可在转录水平减少BACE1表达。TXN2不影响参与APP代谢的其他酶的表达。
4.在HEK/APP细胞中,敲低TXN2使APP代谢产物Aβ表达水平增加,过表达可降低细胞中APP代谢产物Aβ表达。
5.TXN2可抑制NF-κB通路。TXN2敲低基础上,使用p65siRNA抑制NF-κB通路后,可减弱TXN2对于BACE1表达调控。
6.在SH-SY5Y细胞中,TXN2促进抗凋亡蛋白,抑制促凋亡蛋白的表达。
研究结论:
TXN2在老年AD模型小鼠中表达下降。TXN2可通过下调BACE1转录水平抑制APP淀粉样代谢途径,其机制涉及到NF-κB信号通路。以上结果提示提示TXN2可能是AD潜在治疗靶点。
硫氧还蛋白-2(Thioredoxin 2, TXN2)是定位于线粒体的内源性抗氧化酶。氧化应激(Oxidative stress, OS)与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)病理改变有关。本研究主要探讨TXN2与AD病理改变中β-淀粉样前体蛋白(Amyloid-βprecursorprotein,APP)淀粉样代谢途径之间的关系。
研究方法:
1.动物试验
试验动物采用表达瑞典APP和早老素1外显子9突变型(Expressing Swedish APP and presenilin1 delta exon 9 mutations, APPswe/PS1E9)小鼠作为AD模型,野生型(C57BL/6,Wild-type, WT)小鼠作为对照,检测两组在6月和12月龄同年龄小鼠的大脑皮质及海马TXN2蛋白表达差异。
2.细胞试验
免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测TXN2的细胞定位,并研究TXN2对细胞活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平影响。
将TXN2小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)或TXN2质粒,转染至人神经母细胞瘤细胞(Human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)和稳定表达人全长APP的HEK293细胞(HEK293 cells stably expressing human full-length APP, HEK/APP),使TXN2表达降低或过表达。采用免疫印迹试验(Western blot,WB)和逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测TXN2对淀粉样β前体蛋白(Amyloid-βprecursorprotein,APP)淀粉样代谢途径中代谢酶β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)及中间代谢产物影响。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测TXN2敲低或过表达对于APP代谢终末产物β-淀粉样蛋白(Amyloidbetapeptide,Aβ)表达影响。
使用p65siRNA抑制核因子-κB通路(NuclearfactorκB,NF-κB),探究NF-κB通路是否参与TXN2对BACE1的调节。
WB检测过表达或敲除TXN2后,细胞凋亡相关蛋白表达情况。
研究结果:
1.TXN2在12月龄AD模型小鼠大脑皮质及海马的蛋白表达较对照组明显降低。而6月龄小鼠中,两组TXN2蛋白表达无明显差别。
2.在SH-SY5Y细胞中,TXN2定位于细胞线粒体,并可降低细胞内ROS表达。
3.在SH-SY5Y细胞中,敲低TXN2可在转录水平增加BACE1表达,而过表达TXN2可在转录水平减少BACE1表达。TXN2不影响参与APP代谢的其他酶的表达。
4.在HEK/APP细胞中,敲低TXN2使APP代谢产物Aβ表达水平增加,过表达可降低细胞中APP代谢产物Aβ表达。
5.TXN2可抑制NF-κB通路。TXN2敲低基础上,使用p65siRNA抑制NF-κB通路后,可减弱TXN2对于BACE1表达调控。
6.在SH-SY5Y细胞中,TXN2促进抗凋亡蛋白,抑制促凋亡蛋白的表达。
研究结论:
TXN2在老年AD模型小鼠中表达下降。TXN2可通过下调BACE1转录水平抑制APP淀粉样代谢途径,其机制涉及到NF-κB信号通路。以上结果提示提示TXN2可能是AD潜在治疗靶点。