【摘 要】
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低聚半乳糖（GOS）不被肠胃消化吸收,而且是人体肠道中双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌等有益菌极好的营养源和有效的增殖因子,可以改善人体肠道的消化吸收功能,对人类健康有很大的好处。低聚半乳糖是以乳糖为原料,利用半乳糖苷酶对乳糖的半乳糖基转移作用,经水解与合成来生产。近年来,纳米粒子磁场已经用于研究酶的固定化。由于高温利于提高底物溶解性,降低粘度,减少工业成本,预防微生物污染等特点,因此耐热性好、来源广泛、具
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低聚半乳糖（GOS）不被肠胃消化吸收,而且是人体肠道中双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌等有益菌极好的营养源和有效的增殖因子,可以改善人体肠道的消化吸收功能,对人类健康有很大的好处。低聚半乳糖是以乳糖为原料,利用半乳糖苷酶对乳糖的半乳糖基转移作用,经水解与合成来生产。近年来,纳米粒子磁场已经用于研究酶的固定化。由于高温利于提高底物溶解性,降低粘度,减少工业成本,预防微生物污染等特点,因此耐热性好、来源广泛、具有转糖苷活性的糖苷酶成为工业生产糖苷化合物的新选择。目前,许多用于生物技术的酶已经用几种不同的配体共价固定到磁性纳米颗粒上,这种共固定的方法有很多优势,如:利于反应混合物中分离和再利用、降低产品成本、增加酶的热稳定性以及酸碱耐受性、降低传递阻力、解决扩散问题、降低运行成本等等。因此,本论文以耐热性的海栖热袍菌Thermotogamaritima MSB8所产的β-葡萄糖苷酶（Tm-BglA）为研究对象,开展磁性纳米粒子固定化β-葡萄糖苷酶转化乳糖制备乳寡糖的应用研究。1、重组Tm-BglA,N222F,Y295F和F414S转糖苷活性的研究。通过在大肠杆菌中重组表达,热处理、Ni亲和层析制备纯化Tm-BglA、N222F、Y295F和F414S,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对其纯化效果进行检测。同时各阶段利用Bradford法测定蛋白质纯度,采用对硝基苯酚法测定β-葡萄糖苷酶的酶活。测定pH和温度等因素对乳寡糖合成产率的影响,利用薄层色谱法定性分析,优化酶合成乳寡糖条件。结论:N222F最适反应温度为90℃,最适pH为6.0;Tm-BglA,F414S和Y295F最适反应温度为80℃,最适pH为6.0。2、将Tm-BglA与几丁质（CH）,壳聚糖（CS）和海藻酸钠（SA）三种材料分别进行固定化,然后吸引磁性纳米颗粒（MNP）并排与新型热稳定几丁质（Tt-ChBD）。有趣的是,在特定的几丁质磁性纳米颗粒中实现了 Tm-BglA-Tt-ChBD在三种不同底物上的成功固定。透射电子显微镜（TEM）获得的结果表明,成功地获得了 Tm-BglA-Tt-ChBD与CH-MNP的高结合能力。使用培养上清液样品和β-葡糖苷酶固定在CH-MNP,CS-MNP和SA-MNP上后沉淀,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析进一步证实了这一结果。同时,储存稳定性表明游离酶在30天内完全丧失其活性。但是,在孵育30天后,在25℃下CH-MNP,CS-MNP和SA-MNP上的固定化Tm-BglA-Tt-ChBD分别保持其初始活性的79%,63%和68%。此外,结合效率计算表明CH-MNP上固定的Tm-BglA-Tt-ChBD在其第10次重复使用结束时保留了其天然活性的66%。采用三种不同方法进行固定的β-葡糖苷酶成功地用于重复生产GOS,而活性没有明显的损失。3、使用固定化的Tm-BglA优化乳糖水解过程以产生GOS,葡萄糖和半乳糖。采用中心复合设计的响应面法（RSM）通过改变固定化过程的三个参数,温度,溶液pH和底物浓度来优化水解度。基于图和方差分析,发现最大化乳糖水解的最佳操作条件是温度（60℃）,pH（6.3）和底物浓度（250g/L）。采用三种不同方法进行固定的β-葡糖苷酶成功地用于重复生产GOS,而活性没有明显的损失。
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