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目的：采用脂质体转染法,构建Smad3 WT, Smad3 EPSM及Smad3 3S-A三种质粒稳转HepG2细胞株,探究：1.转染三种质粒本身对HepG2细胞形态及增殖的影响；2.选择性上调pSmad3C/pSmad3L对HepG2细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响；3复方芪参提取物(Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract, CASE)对选择性上调pSmad3C/pSmad3L的HepG2细胞增殖抑制及凋亡的影响。方法：1.细胞培养与处理体外培养HepG2细胞在无血清DMEM培养基下培养24 h,加或不加CASE(20,40,80 μg/ml)处理,随后根据不同的实验要求,加入不同浓度的TGF-β1刺激不同的时间；对照组细胞加入等量的溶媒。2.转染Smad3 WT, Smad3 EPSM及Smad3 3S-A三种质粒的稳转细胞株的建立HepG2细胞体外培养,使用脂质体转染法将三种质粒Smad3 WT、Smad3 EPSM及Smad3 3S-A转入HepG2细胞中,经筛选浓度的G418 (600μg/ml)筛选二周,维持浓度的G418 (300μg/ml)维持四周,获得稳转细胞株并扩大培养。3. Western-blot和细胞免疫荧光检测法稳转细胞株目的蛋白的表达3.1 Western-blot法HepG2及稳转Smad3 WT, Smad3 EPSM, Smad3 3S-A三种质粒的HepG2细胞株体外培养,培养结束后提取各组细胞总蛋白,采用Western-blot法,以GAPDH为内参,检测细胞内Smad3, pSmad3C, pSmad3L蛋白表达；3.2细胞免疫荧光法HepG2及稳转Smad3 WT, Smad3 EPSM, Smad3 3S-A三种质粒的HepG2细胞接种到24孔板的无菌玻片上,培养结束后取出玻片进行固定、封片,分别给予相应的一抗孵育过夜,然后再使用荧光标记的二抗孵育,荧光显微镜下观察pSmad3C, pSmad3L蛋白表达并拍照。4.MTT法检测转染Smad3WT, Smad3EPSM及Smad33S-A质粒及CASE干预对HepG2细胞增殖的影响HepG2及稳转Smad3 WT, Smad3 EPSM及Smad33S-A三种质粒的HepG2细胞株体外培养,无血清DMEM饥饿过夜,药物组给予相应浓度的药物共同培养24h,实验结束前16h各组分别加入9 pmol/L的TGF-β1共培养,使用酶标仪570nnm处测每孔吸光度OD值。5.流式细胞术检测转染Smad3 WT, Smad3 EPSM及Smad3 3S-A质粒及CASE干预对HepG2细胞周期和凋亡的影响HepG2及稳转Smad3 WT, Smad3 EPSM及Smad3 3S-A三种质粒的HepG2细胞株体外培养,无血清DMEM饥饿过夜,药物组给予相应浓度的药物共同培养24h,实验前1h各组分别加入9pmol/L的TGF-β1共培养,流式细胞仪检测各组细胞周期和凋亡情况。结果：1.Western-blot及免疫荧光法检测结果显示与正常HepG2细胞相比,稳定转染三种不同质粒(Smad3 WT, Smad3 EPSM, Smad3 3S-A)组Smad3蛋白的表达量明显增多,TGF-β1刺激后,转染Smad3 WT质粒组细胞pSmad3C/pSmad3L蛋白水平显著上调；转染Smad3 EPSM质粒组细胞pSmad3C蛋白水平上调明显,而pSmad3L蛋白表达较正常HepG2细胞无显著差异；转染Smad3 3S-A质粒组细胞pSmad3L蛋白水平显著增加,pSmad3C蛋白水平较正常HepG2细胞无显著差异。2.MTT结果显示,转染三种质粒对HepG2细胞增殖几乎没有影响,TGF-β1刺激能够诱导稳转细胞株的细胞增殖,且转染Smad3 EPSM质粒的HepG2细胞,较未转染、转染Smad3 WT或Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞对TGF-β1诱导的细胞增殖反应减弱(P<0.05),三种浓度的CASE(20,40,80mg/L)干预均能抑制由TGF-β1诱导的稳转细胞株的增殖(P<0.01),且对转染Smad3 EPSM质粒的HepG2细胞,较未转染、转染Smad3 WT或Smad3 3S-A质粒的HepG2细胞增殖抑制作用较强(P<0.05)。3.流式细胞术细胞周期结果显示,TGF-β1刺激下,转染Smad3 EPSM质粒组G0/G1期细胞数明显增多,而转染Smad3 3S-A质粒组G2/M期细胞数增加明显(P<0.01)。凋亡结果显示,TGF-β1刺激下,较未转染和转染Smad3 WT质粒组,转染Smad3 EPSM质粒组细胞凋亡率显著增加,而转染Smad3 3S-A质粒组细胞凋亡率显著降低(P<0.01),高剂量的CASE干预后各组细胞凋亡率明显升高(P<0.01),且对转染Smad3 EPSM质粒细胞的促凋亡作用高于转染Smad3 WT质粒和Smad3 3S-A质粒细胞组(P<0.05,P<0.01)。结论：1.成功建立Smad3 WT, Smad3 EPSM及Smad3 3S-A稳转HepG2细胞株。2.初步探究证实选择性增加HepG2细胞中pSmad3C蛋白表达,可抑制细胞增殖,诱导细胞阻滞于G0/G1期,促进细胞凋亡；而选择性增加pSmad3L蛋白表达,可促进HepG2细胞增殖及推动周期进程,抑制细胞凋亡。3. CASE(20、40、80mgJL)三个剂量呈浓度依赖地抑制由TGF-β1诱导的各组细胞增殖,且对pSmad3C蛋白高表达的增殖抑制作用明显高于pSmad3L蛋白高表达的HepG2细胞。4.高浓度的CASE (80 mg/L)对各组细胞具有明显的诱导细胞凋亡作用,且对pSmad3C蛋白高表达的凋亡诱导作用明显高于pSmad3L蛋白高表达的HepG2细胞