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本研究根据荧光探针设计原理和基于结构的药物分子设计原理,在荧光团兼蛋白靶向的药效团1-氧-1H-非那烯-2,3-二腈（1-oxo-1H-phenalene-2,3-dicarbonitrile,OPD）衍生物的研究基础上,通过调控发色团的反应活性和改变不同理化性质的取代基以及空间位置,获得特异性识别蛋白质等不同目标分析物的荧光探针,开展了以下研究工作。在OPD的6位引入不同供吸电子能力的苯硫基作为离去基团和荧光猝灭基团,获得新型特异性识别谷胱甘肽（GSH）的荧光探针O-NH2。4-氨基苯硫基通过PET作用淬灭探针的荧光,但是作为离去基团与GSH的巯基发生芳香亲核取代反应（SNAr）之后,荧光发生显著增强。再利用4-氨基苯硫基的供电子能力降低与其它硫醇的SNAr反应活性,只有当探针与GSH发生静电相互作用的条件下,O-NH2才能特异性识别GSH,实现对GSH的turn-on型荧光检测。基于该探针对GSH的高选择性、高灵敏度和低细胞毒性等性质,以其作为分子工具用于梯度伊马替尼耐药的白血病细胞系K562细胞中GSH的水平的半定量研究和荧光成像以及大型蚤和斑马鱼胚胎中GSH的原位荧光成像。在OPD衍生物2位引入不同弱吸电子能力的酯基和硝基苯基团,不同程度的降低OPD衍生物6位与亲核试剂的反应活性,获得一个基于反应的turn-on型特异性识别丙酮酸激酶M2亚型（PKM2）的荧光探针AT-OPC1。2位较低吸电子能力的酯基进一步降低了 OPD衍生物6位的反应活性,避免细胞内游离的亲核性物质的干扰。只有在AT-OPC1与靶蛋白发生非共价结合的条件下,探针才能够与结合位点附近的亲核氨基酸残基发生反应。实验证明AT-OPC1能够选择性的标记GSH、Cys和Lys并表现出低于AT-OPD的反应活性,并在细胞环境中特异性的标记癌症相关蛋白丙酮酸激酶M2亚型（PKM2）,而不受非蛋白硫醇以及含有亲核基团的生物物质的干扰。AT-OPC1在细胞原位和蛋白质组水平上,特异性结合PKM2的赖氨酸残基Lys305并实现了荧光turn-on响应,能够通过凝胶荧光成像和细胞荧光成像反映细胞内PKM2蛋白的水平变化。根据OPD衍生物与肿瘤靶标蛋白Bcl-2和Mcl-1的结合模式,在其6位引入强供电基团和3位的取代基修饰,彻底去除6位的反应活性,提高与靶蛋白亲和力的同时,增强了分子的荧光性能,获得集荧光发光和Bcl-2/Mcl-l抑制活性为一体的荧光抑制剂。其中,6位哌嗪基团的取代增强了与Bcl-2/Mcl-1的蛋白亲和力,进一步通过3位氰基的取代,减弱分子内电荷转移（ICT）使分子荧光增强,获得Bcl-2和Mcl-1蛋白荧光抑制剂S1-4A;在6位引入三氮唑甲胺基团,增强ICT过程使分子荧光增强,获得荧光抑制剂S2-2。以化合物S1-4A和S2-2为代表的荧光抑制剂分子分别表现出黄绿色和红色荧光,对Bcl-2和Mcl-1蛋白的竞争结合常数Ki均达到亚微摩尔级别,优于或达到了商品化Bcl-2/Mcl-1蛋白双抑制剂R-（-）-gossypol的亲和力。同时,S1-4A和S2-2表现出显著优于R-（-）-gossypol诱导Bcl-2/Mcl-1蛋白双依赖肿瘤细胞凋亡的能力。以Bcl-2/Mcl-1蛋白抑制剂S1-4A的荧光发光性质和蛋白结合性质为基础,在OPD衍生物上引入光交联基团和“点击化学”基团,获得Bcl-2/Mcl-1蛋白基于活性的分子探针（Activity-based probe,ABP）BnN3-OPD-Alk。该探针将蛋白抑制活性、荧光发光性质和富集分离功能集成在一个分子骨架中,避免现有的ABP对靶蛋白结合能力降低、合成步骤繁琐的缺陷,也省略了细胞内金属Cu（Ⅰ）催化环节。探针BnN3-OPD-Alk展现出良好的荧光性能以及对靶蛋白Bcl-2/Mcl-1蛋白亚微摩尔亲和力,成功应用到体外重组的Bcl-2/Mcl-1蛋白、体外生理体系中Bcl-2蛋白、细胞内Bcl-2和Mcl-1蛋白的荧光标记,Bcl-2和Mcl-1蛋白荧光成像,并且应用于蛋白质组水平和细胞原位的Bcl-2/Mcl-1蛋白的分析鉴定,以及原位筛选Bcl-2/Mcl-1抑制剂类抗癌先导药物。